第九章 植物细胞培养PPT.pptVIP

2、抑制法：使用DNA合成抑制剂，也可使细胞培养同步化。当细胞受到这些化学药物处理后，由于这些核苷酸类似物的存在阻止了DNA的合成，细胞周期只能进行到G1期，细胞都滞留在G1期和S期的边界，当把这些抑制剂除去后，细胞就进入同步分裂。 为了改善液体培养基中材料的通气状况，需进行培养基的不断振荡：（1）旋转培养（2）往返振荡培养（3）旋转振荡培养（4）搅动振荡培养 五、培养基的振荡 1、培养基成分：N6，MS，B5适合单子叶植物细胞，MS，B5，LS，SL适合双子叶植物细胞。条件培养基适合单细胞和低密度细胞培养。需要硝态氮、铵态氮、无机磷浓度更高。 六、影响细胞培养的因素 2、细胞密度：培养基的成分和起始细胞密度对单细胞培养成败有影响。 起始密度：细胞培养最低的有效密度，即能使细胞分裂、增殖的最低接种量，低于这个密度细胞不能分裂，甚至很快解体死亡。 3、植物生长调节剂：细胞悬浮培养时，常表现一种自然的聚集现象，加入2，4-D，少量水解酶或酵母提取液，能够增加细胞的分散度。 4、pH和二氧化碳浓度 在悬浮培养时，PH变动相当大。加入EDTA使铁和其他金属离子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作为稳定PH的一种方法。 二氧化碳对细胞培养没有太大影响，但在低密度细胞培养中，二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用。 第九章 植物细胞培养 第一节 单细胞培养 第二节 细胞悬浮培养 第三节 植物细胞生长和活力的测定 第四节 植物细胞培养的应用 植物细胞培养，即对植物器官或愈伤组织上分离的单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。 第一节 单细胞培养 一、定义 单细胞培养：对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再经过分化形成芽、根等器官或胚状体，甚至长成完整植株的技术。 二、意义 1、建立单细胞无性系 2、对培养的单细胞可以诱发突变 3、排除体细胞干扰 4、遗传转化受体的建立 三、单细胞的分离 叶组织是分离单细胞的最好材料， 1、机械法：叶片组织轻轻研碎，匀浆过滤或离心，得到纯化细胞。 特点：细胞不受酶伤害，不会发生质壁分离。 不适用于所有植物 2、酶解法：利用果胶酶处理叶片，使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞。 特点：必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞胀裂。 （二）微室培养法 人工制造一个小室（载玻片和盖玻片），将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。小室可通过毛细管与外界通气，便于观察。 注意载玻片厚度1mm，微室厚度最好不超过20um，盖玻片厚度在0.17-0.18mm左右，观察效果才好。 （三）平板培养法 平板培养法是把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。 步骤： 1、单细胞悬浮液的制备 2、悬浮细胞密度的调制 3、琼脂培养基的配制 4、平板制作 5、培养 （四）条件培养基：在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。 方法：把液体培养基中培养了4-6周的高密度细胞过滤掉，将其培养基制成液体培养基或固体培养基来培养单细胞或低密度细胞群体，这样可明显提高单细胞培养物存活和分裂的能力。 第二节 细胞悬浮培养 细胞悬浮培养是使离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。建立在愈伤组织的液体培养技术基础上。目前已发展到全自动控制的大容积发酵罐的大规模工业生产的连续培养。为研究细胞的生长和分化提供了一个独特的实验系统。 1、愈伤组织诱导 材料自来水冲洗——75%的乙醇擦洗——将材料切成小块（带形成层）——接种到MS+2,4-D 2mg/L+CH 500mg/L+琼脂0.8%,pH5.8的培养基上——得愈伤组织——扩大繁殖。 2、单细胞悬浮液的制备 愈伤组织转移到液体培养基中——4r/min转床培养10d——140m×140m的细胞筛过筛——使细胞密度达到10 个/ml左右——得单细胞悬浮液。 一、前期准备 在细胞悬浮培养中，采用生长快、有效成分高、适合悬浮培养的细胞株。筛选细胞株的方法是：（1）从培养的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长快的浅色愈伤组织。（2）用振荡或酶法，游离出单个细胞或小细胞团。（3）接种在固体培养基上培养2周。（4）挑选生长快的细胞株并继代培养。（5）取各细胞系的培养物，进行有效成分的测定，筛选出有效成分高而生长较快的细胞株。 二、培养类型和方法 （一）成批培养 指把细胞分装在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，