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现代微生物学技术 第三章 应用微生物学技术;本章内容 第一节 微生物的接种与培养技术 第二节 微生物菌种的筛选与分离技术 第三节 微生物的菌种保藏技术 第四节 显微镜技术 第五节 免疫标记技术;3.1 微生物的接种与培养技术 一、微生物接种技术 微生物接种就是将一定量的纯种微生物转移到另一新鲜培养基中的过程。这是进行微生物实验时最重要的基本操作之一，要求在严格的无菌条件下进行。 接种工具：接种针、接种环、接种铲、玻璃涂棒、滴管和移液管等 接种方法：试管斜面接种、液体接种、穿刺接种和平板接种等 ;二、微生物的培养技术 一）固体表面培养 固体表面培养是指微生物菌落生长在固体培养基的表面或里面的培养方法，该培养方法广泛用于培养好气性微生物的菌落形态观察、保藏、分离和细胞计数等。 表面培养法培养微生物有下列特点： 1、细胞多半是重叠地生长繁殖，因此直接与培养基相接触的细胞和在此细胞上再生长出的细胞会有所不同。 2、从摄取营养的角度来看，上面的细胞就得通过下面的细胞或细胞间隙来获得营养。 3、从供氧方面来说，从上到下逐渐形成缺氧的环境。;;液体培养法有： 1、振荡培养 用于培养细菌、酵母菌及藻类等单细胞微生物，得到均一的细胞悬浊液，培养真菌或放线菌一类菌丝状细胞，则可得到糊状的培养物，如果振荡不充分，培养物的粘度又高，会形成许多小球状的菌团培养物。 设备：箱式恒温振荡器、往复式振荡床（摇床） 培养器：试管、三角烧瓶;HZQ-X100恒温双层振荡培养箱;2、通气培养 一般是用玻璃制成的圆筒状的容器，主要部件有发酵罐主体、温度调节系统、搅拌系统、空气过滤系统、空气流量计以及各种检测仪表。 通气培养设备具有如下优点： 1）可以大量生产微生物细胞和代谢产物； 2）根据需要可随时调节氧的供给速率、营养物的流加量、温度以及pH等； 3）可直接观察发酵罐中的培养物以及培养液的变化情况，给研究工作带来方便。;;三）厌氧培养 厌氧培养是指在无氧的条件下进行微生物的发酵培养，可采用的原理有两个方面：一是除去培养容器中的氧气；二是增强培养基的还原能力。 厌氧培养的方法很多，较普遍的有： 1、在培养基中加入可溶性的还原性化合物；如葡萄糖、半胱氮酸、甲酸钠、硫代羟乙酸（HSCH2COOH）和它的盐等，以增强培养基的还原能力。 2、用惰性气体或还原性气体完全代替空气；如以N2、H2、CO2取代空气。 3、利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气；焦性没食子酸在碱性条件下可与氧结合生成焦性没食子素。;碳酸氢钠 氢硼化钠;;四）同步培养 同步培养主要是为了使培养液中的全部细胞能处于同一生长阶段（即同时进行分裂、生长、分裂）而设计的培养方法，即同步培养。 获得同步生长细胞的方法有二种： 1、选择法： 选择法是通过过滤、密度梯度离心、膜吸附和直接选择等方法，从细胞群落中选择仅处于某生长阶段的细胞来进行培养的方法。 ;2、诱导法：诱导法是通过改变细胞群落的环境条件，如交替的温度变化、营养变化、使用能够影响细胞生长周期的主要代谢抑制剂，从而使同一培养容器中的全部细胞都处于同一个生长阶段。 1）温度法：短时间低温处理，特异性地阻止细胞分裂，再恢复最适分裂温度获得同步温度培养物。 2）饥饿法：通过除去培养基中的葡萄糖、氨基酸、胸腺嘧啶等营养源进行培养而获得同步培养物。一般是在少量的营养中使微生物进行对数增殖，使营养耗尽，然后再转入适宜的培养条件。;五）微生物的连续培养 当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流入新鲜培养基和通入无菌空气，并立即搅拌均匀；另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。于是容器内的培养物就可达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和衡定的生长速率上，于是形成了连续生长。 微生物以连续生长方式进行的培养称为连续培养;;六）透析培养 透析培养是用透析膜隔开的相邻两液相间，一面由透析膜调节物质转移，除去了有害物质的积累；另一面进行微生物培养的方法，可提高细胞浓度。 透析培养的特点： 1、延长了发酵的对数增殖期，使菌体细胞的密度增加，为提高目的物产量创造了有利条件。 2、消除终产物的反馈抑制，使酶活力增强，代谢功能旺盛。 ;3.2 微生物菌种的筛选与分离技术 选育菌种可以从以下方面着手： 1、根据新的要求与微生物本身遗传变化的关系，从原有菌株入手进行各种遗传改造工作（诱变、基因改造）。 2、根据文献资料报导的微生物种属，向国内外菌种保藏机构索取同种或同属的菌株，从中寻求符合要求者