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第四章：基因工程载体; 能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的DNA大分子称之为载体。 ;理想的载体应具备的条件： ;;第一节：质粒载体;一. 质粒的生物学特性;质粒(plasmid );1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。 2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。 3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制。 4、寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。;5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。;;转移型和非转移型质粒;Ⅱ. 按表形分类; F+ 又叫雄性决定因子，致育因子。所以F+细胞又叫雄性细胞，相应的 F– 又叫雌性细胞。 F质粒在寄主细胞中有四种不同存在方式： ① F+ ② F– ③ Hfr ④F’。 ;F质粒的四种存在方式和相互关系;　这是一类普遍而重要的质粒，主要包括抗药性和抗重金属二大类，简称 R 质粒。 带有抗药性质粒的细菌有时对于几种抗生素或其他药物呈现抗性。例如 R1 质粒 (94kb) 可使宿主对下列五种药物具有抗性：氯霉素 、链霉素 、磺胺 、氨苄青霉素 和卡那霉素 ，并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于 R1 抗性质粒上。 许多 R 质粒能使宿主细胞对许多金属离子呈现抗性，包括砷 (As3+) 、汞 (Hg2+ ) 、镉 (Cd2+) 等。在肠道细菌中发现的 R 质粒，约有 25% 是抗汞离子的，而铜绿假单胞菌中约占 75% 。 ;　因这类质粒首先发现于大肠杆菌中而得名，该质粒含有编码大肠菌素的基因。 大肠菌素是一种细菌蛋白，只杀死近缘且不含 Col 质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素的影响。;4. 毒性质粒;三. 质粒DNA分子的三种构型：;单链切割;各构型在凝胶电泳中的表现：;四. 质粒的命名; pBR322质粒是按照标准的质粒载体命名法则命名的。“p”表示它是一种质粒；而“BR”则是 分别取自该质粒的两位主要构建者F．Bo1ivar和R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母，“322‘’系指实验室编号。;1 天然质粒用作载体的局限性;2. 质粒的构建;3. 构建质粒的分类（按用途分） ? 多拷贝质粒：用于扩增外源基因。 ? 测序质粒：加装测定顺序所必需的序列。 ? 整合质粒：装有整合促进基因及整合特异序列。 ? 穿梭质粒：能在两种不同的受体细胞中复制。 ? 表达质粒：装有强的启动基因。 ? 探针质粒： 筛选克隆或寻找基因元件。;六. 常用质粒载体 ;pSC101 ;质粒分子量较大 拷贝数低 只具有一个抗菌素抗性基因，无法使 用插入失活技术选择重组分子;2. pBR322 ;（2）特点;（3）重组克隆的 “插入失活”筛选方法 ;Amp r;; pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。 它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker. ;pUC系列质粒载体 ;3. 含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用?-互补原理进行蓝白筛选。 ;; X-gal是β-半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当外源基因插入到pUC质粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。;;诱导物;标志补救（?-半乳糖苷酶法）;X-gal;（LacZ基因 N端序列）;可用蓝白斑方法进行第二道筛选;4. T-载体 ;T-载体最初由 Promega 公司开发出商品，并一直沿用到现在，如和 pGEM-T 。 ; 将普通的克隆载体切成线状，并使之在 3 末端含有一个凸出碱基 T 。 ;5. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector） 是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。;大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体;6. 柯斯质粒载体 cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末