第四章 基因工程的主要技术及其原理PPT.ppt

加热 变 性 复性 复温 DNA的变性和复性 加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 PCR反应条件 PCR过程 PCR反应条件 PCR过程 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 PCR技术 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 模板DNA 95℃ PCR技术 复习 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR技术 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR技术 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 PCR技术 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR技术 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 PCR技术 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 重复30轮后 230=1,073,741,824 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 PCR技术 2 PCR技术的特点 1 ）高度的灵敏性 30轮循环 扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR产物每轮循环增加一倍 2 ）特异性 引物 引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 3）操作简便易行 PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。 目的基因 载体 复制子 宿主细胞 扩增 扩增 提取DNA分子 4 ）用途广泛 生命学科 医学工程 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学 PCR的反应体系和方法 PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。 ? 1 反应体系 标准的PCR反应体系 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 　　　　 　 各10～100pmol 模板DNA 　　　 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Buffer （Mg2+ ）　 1.5mmol/L PCR技术 PCR技术的基本过程(1) 模板DNA dNTP 引物 Buffer 预变性 模板DNA dNTP 引物 Buffer TaqDNA聚合酶 94oC5’ 2 基本过程 Western Blot常见问题分析 SDS电泳 胶不平？ 凝胶漏液？ 胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐 条带比正