第四章 真核细胞中的基因表达调控PPT.pptVIP

第四章?????? 真核细胞中的基因表达调控 第一节??????? 真核细胞基因表达的调控 第二节??????? 哺乳动物细胞表达系统的选择 标记基因 第三节??????? 真核细胞表达系统的载体种类 第一节??????? 真核细胞基因表达的调控 一、真核生物基因表达的特点及优势 二、真核细胞表达及调控元件 第二节??????? 哺乳动物细胞表达系统的选择标记基因 一、胸苷激酶基因选择标记（定义） 二、二氢叶酸还原酶基因选择标记 三、新霉素抗性基因选择标记 四、氯霉素已酰转移酶基因选择标记 五、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT）基因 第三节??????? 真核细胞表达系统的载体种类 一、载体的类型 二、几种常用的真核表达载体 一、 真核生物基因表达的特点及优势 1.细胞的全能性 2.转录和翻译分开进行 3.有相当大的非编码区（调控序列） 4.有三种不同RNA聚合酶参与转录 5.初级转录产物能进行剪接加工修饰 6.不存在操纵子结构 7.基因多拷贝，功能基因分散在不同区域，分别转录 胸苷激酶 胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（thymidine Kinase,TK）在所有真核细胞中都有表达, 是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶, 它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP, 继续磷酸化生成dTTP, 参与DNA的生物合成。 一、载体的类型 1.质粒型载体 2.病毒载体 3.整合型表达载体 4.游离型表达载体 5.瞬时表达载体 6.稳定性表达载体 7.非复制性HSV-Ⅰ病毒（单纯疱疹病毒HSV-Ⅰ型）载体 8.裂解性HSV-Ⅰ病毒载体 二、几种常用的真核表达载体 ㈠ 逆转录病毒载体 1.卸甲载体 2.穿梭载体 ㈡ 痘类病毒载体 ㈢ HSV-Ⅰ单纯疱疹病毒载体 1.重组病毒型载体 2.重组质粒型载体 3.裂解型病毒载体 （一）真核生物基因转录水平的调控 基因调控的顺式作用元件 启动子 增强子 RNA剪接信号 负调控元件 终止子和polyA信号 基因调控的反式作用因子 概念 反式作用因子主要作用规律 （二）转录后水平的调控 mRNA前体加工：转录的mRNA前体经5’加帽，3’酶切加尾去除内含子后，产生成熟mRNA，通过核孔进入胞质中。 RNA编辑（RNA editing） （三）翻译水平的调控 翻译起始序列 eIF-2的磷酸化反应 由模板来源的遗传信息，进而可编码产生不同氨基酸序列的多种蛋白质，这是生物适应性的保护措施。 顺式作用元件 顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录按效应和功能可分为启动子、增强子、RNA间接信号、负调控元件、终止子等调控元件。 反式作用因子主要作用规律 同一DNA序列可被不同蛋白质识别 同一蛋白质因子可与多种不同DNA序列发生联系，多数是通过蛋白质-蛋白质先相互作用后，再与DNA结合，发挥调节作用。 反式作用因子的自身生物合成有相当大的可变性、可塑性。反式作用因子与顺式作用元件相互作用的特定结构域，有两种类型： 通用转录因子的结构域为识别特异DNA的DNA结合结构域，如：锌指结构。 转录调节因子的结构域又称转录活化结构域，如：酸性α-螺旋结构域。 不同结构域各自的特征 不同结构域各自的特征 通用转录因子的DNA结合结构域 锌指结构 亮氨酸拉链 螺旋-转角-螺旋（HTH） 螺旋-环-螺旋 转录调节因子的转录活化结构域 RNA编辑（RNA editing） RNA编辑是在转录时或转录后，能够改变RNA分子编码特性，是与剪切形式不同的一种修饰形式，如可使mRNA某位点密码子CAA转变为UAA，使C变U，编辑的结果形成了UAA终止密码子，在编码酶的作用下，除使C变U，还可在RNA上添加多个U或呈单个C的添加，使前体mRNA变成成熟mRNA时，通过插入或替换方式，可改变和扩大原遗传信息，编码多种蛋白,是生物的适应性保护。 翻译起始序列 在ATG起始密码子周围要有5’-CCACCA-TGG-3’保守序列，以利mRNA翻译起始，若发生突变，其翻译水平可下降10倍。在起始AUG上游若有比较多的二级结构序列，也会影响翻译，建议外源基因的5’端AUG上游序列不宜过长。 eIF-2的磷酸化反应 eIF-2为转译起始因子-2是蛋白质合成起始阶段13种起始因子中最为关注的因子。若转入动物细胞中的质粒DNA的两条链一旦都发生转录，就会形成双链互补mRNA，而激活胞内的双链RNA激活的蛋白激酶（DAI PK）该激酶可使eIF-2的α-亚基磷酸化，转译受抑，为防止该激酶活化，常在载体上加上腺病毒的VARNA基因，VARNA是由RNA聚合酶Ⅲ合