第八章 动物基因工程PPT.ppt

（4）超声波法（sonoporation） 超声波增强基因转染法的主要机制是声波的空化效应导致细胞的通透性增高，而通过添加超生造影剂能降低空化域值，增强空化效应，促进外源基因进入细胞，提高基因的转染效果 2.化学转染法 （1）磷酸钙法 将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2后，DNA片段与磷酸钙共沉淀并形成大的颗粒；将此颗粒悬浮液加入贴壁培养的细胞中，外源DNA就被靶细胞所吸收，进而实现转基因。 利用磷酸钙共沉淀法进行DNA转染 质脂体介导的基因转移 （2）脂质体法（lipofection） 将待转染的DNA溶液与磷脂混合，后者在表面活性剂存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。当这种脂质体悬液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜发生融合，DNA片段随即进入细胞质或细胞核内。 （3）原生质体融合法 含有目的基因的质粒转化细菌或酵母细胞。大量扩增，利用溶菌酶或蜗牛酶去除胞壁部分，在高盐条件下制成原生质体，然后散铺在单层培养的哺乳动物细胞上，在 融和剂（如聚乙二醇）作用下，使染色体或质粒转如细胞内，实现转基因 构建含有选择性标记的反转录病毒基因组部分DNA与质粒的杂合型载体分子，在多克隆位点插入外源基因形成重组DNA分子，克隆到大肠杆菌中扩增鉴定；重组DNA分子通过物理或化学方法转入一个特制的病毒包装细胞系。转染入包装细胞系的重组DNA转录出相应的重组RNA分子，包装细胞系分泌出来的重组反转录病毒，便可感染其他类型动物受体细胞，重组RNA分子以DNA形式整合到染色体上，并表达外源基因。 3.病毒感染法 逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因 原病毒DNA转染进包装细胞中，包装原病毒产生将病毒RNA包装成感染性病毒粒子的所有蛋白质，但却不能包装自身的RNA 第三节 转基因动物制备 转基因动物的制备程序 转基因鉴定 表达水平的检测 转基因动物传代与检测 一 转基因动物的制备程序 DNA显微注射法制备转基因小鼠 胚胎干细胞法制备转基因小鼠 转基因体细胞核移植法生产转基因牛 1、DNA显微注射法制备转基因小鼠 超数排卵 基因制备 胚胎移植 显微注射 转基因个体的鉴定 显微注射技术 2、胚胎干细胞法制备转基因小鼠 胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团中分离出的未分化、具有正常二倍体染色体和发育全能性的细胞。 优点： 可以在体外进行人工培养、长期扩增、冷冻保存 胚胎干细胞制备转基因动物过程 （1）转基因胚胎干细胞的获得 （2）囊胚注射 （3）嵌合体的检测和育种 胚胎干细胞基因转化法 (引自G1ick Pasternak，1998) 判断是否是种系嵌合 首先用转基因嵌合体的小鼠与正常的小鼠交配，对其后代进行检测，如果后代中有转基因个体出现，证明为种系嵌合，然后将转基因杂合子个体进行横交就会获得转基因纯合子和杂合子个体。如果在后代中没能发现转基因纯合子，应注意是否因为转基因的纯合造成了胚胎的早期死亡，无法得到成活个体所致。 基因的准备 供体细胞获取 传代培养、扩增 供体细胞的转基因 转基因供体细胞的筛选与扩增 卵母细胞的获得 体外成熟培养 卵母细胞的去核 核移植 重构胚体外培养 胚胎移植 获得转基因个体 3、转基因体细胞核移植法生产转基因牛 步骤一：从一只６岁芬兰多塞特白面母绵羊（姑且称为Ａ）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为“供体细胞”；步骤二：从一头苏格兰黑面母绵羊（Ｂ）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”；步骤三：利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成“胚胎细胞”；步骤四：将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（Ｃ）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊--多莉。 二 转基因鉴定 标记筛选法 （1）正负选择标记筛选法 （2）无启动子筛选法 利用靶基因上的启动子来转录标记基因的mRNA并翻译出特定的蛋白质，而达到筛选的目的。 分子鉴定法 （1）PCR扩增 （2）斑点杂交 （3）Southern杂交 （4）荧光原位杂交 三 表达水平的检测 获得高效表达、具有较强生物学活性的目的是蛋白是转基