用根癌农杆菌介导EPSPS基因遗传转化拟南芥研究.docVIP

用根癌农杆菌介导EPSPS基因遗传转化拟南芥研究 　　摘要：研究通过花序浸染法，将EPSPS基因导入拟南芥(Arabidopsis thaliana) Col(Columbia)生态型植株中，通过卡那霉素对种子的抗性筛选及常规PCR对再生植株进行阳性鉴定。初步证明，EPSPS基因已经成功转化拟南芥，经过反复筛选，获得转基因纯系植株。 　　关键词：拟南芥；PCR检测；EPSPS 　　中图分类号：Q946 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-04-0060-2 　　 　　拟南芥是典型的十字花科植物，因其独有的生物学特性而成为生物学研究者常用的模式植物，被誉为植物界的“果蝇”。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS），是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶，参与生成生物碱、维生素、香豆素、吲哚类衍生物、酚类、类黄酮和木质素物质等次生代谢物的合成。当给植物喷施草甘膦时，草甘膦与EPSPS结合，阻止了此酶的活性，导致氨基酸合成受阻，随后植株死亡。农业上用除草剂草甘膦就是根据这个原理消灭植物的。其中G2-aroA基因是来自草甘膦生产厂周围污染土壤中的荧光假单胞菌，该基因编码的EPSP合酶作为植物体内源EPSP合酶的同功酶，其构象差异造成对草甘膦亲和性下降，从而使植株获得抗药性。为了研究EPSPS基因在拟南芥中的表达，我们采用花序浸染的遗传转化方法，对拟南芥进行遗传转化，得到转化后的种子。对转化种子进行抗性筛选，得到抗性筛选植株，并进行PCR检测，进一步筛选阳性的转基因植株。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 实验材料 转EPSPS基因的大肠杆菌EPSPS-DH5α和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EPSPS-EHA105由实验室保存。拟南芥生态型Col(Columbia)。 　　1.1.2 主要试剂 植物凝胶（WaKo），MS粉（Sigma），卡那霉素（Bio BASIC INC），CTAB，各种引物（由英俊生物技术有限公司合成），TaqDNA聚合酶（Tiangen Biotech）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 拟南芥植株的培养 将拟南芥种子在4℃冷藏箱中春化3d左右。将腐殖土和蛭石以2：1混匀，经高压灭菌后装入到直径为8cm的塑料盆中，用水将盆中的土壤浇透。把春化好的拟南芥种子用灭菌水浸泡24h后，用移液枪吸取，均匀的种植在盆中，并将小盆置于灌有自来水的大塑料盘中置温室中培养，温度恒定为22℃，置于短日照（10h以下），温室中培养4周后转放到长日照条件下（光照12h以上）诱导抽苔开花。 　　1.2.2 花序法介导拟南芥的遗传转化 （1）转化前准备 拟南芥在温室或人工气候室生长到一定时间。当开始抽苔时，去掉主苔，大约一周后，次生苔高度大约5cm时，对植株停止浇水，准备进行遗传转化。（2）浸染液的制备 将带有目的质粒的农杆菌EPSPS-EHA105单菌落接种于LB液体（含Kan 50 mg#8226;L-1）培养基中，于28℃培养至OD600约为0.8时，然后以6000rpm、4℃离心10min收集菌体，将菌体在含有大量元素，微量元素，B5维生素，5%蔗糖，0.01 mg#8226;L-1 BAP，0.02% silwetL-77的1/2MS（pH为5.7）中重悬。重悬的菌液用于转化拟南芥。（3）拟南芥花序的浸染 将重悬的菌液分装到烧杯里，将拟南芥植株花序淹没在浸染液中30s,并轻轻旋转烧杯。将浸染后的植株套袋以保湿，暗室培养24h。并隔天浇水，保持湿润状态。待种子长大，植株自然开裂时收获种子。 　　1.2.3 转基因种子的抗性筛选 将收获的拟南芥种子在超净工作台中用75%乙醇及2.5%次氯酸钠消毒，消毒完毕后铺在含50mg#8226;L-1 Kan的MS培养基中，放在4℃冰箱中春化2d后，置于22℃温室中光照培养7-9d，观察植株生长现象。根据生长状况判断是否为转基因植株。 　　1.2.4 再生植株的PCR鉴定 采用CTAB法抽提拟南芥再生植株DNA用于PCR反应。用质粒抽提试剂盒提取大肠杆菌（Escherichia coli）EPSPS-DH5α中的质粒DNA作为扩增的阳性对照，以未转染拟南芥植株的DNA做为阴性对照。引物序列根据EPSPS基因序列设计： 　　F：5′-GGCTTGCCTTCCAGATGA-3′ 　　R：5′-ATAGCGGTTCCAGCGTTT-3′ 　　扩增产物为375bp，PCR条件为94℃下3min，94℃30sec，53℃30sec，72℃30sec复性并延伸，33个循环，72℃延伸5min，将扩增得到的PCR产物用0.8%琼