第三章 基因工程的酶学基础PPT.ppt

基因工程的酶学基础 ;限制性核酸内切酶 ＤＮＡ连接酶 DNA聚合酶; 限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。; 寄主控制的限制（restriction） 与修饰 (modification) 现象： 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。 ;; E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。; R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解;限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶;Ⅰ型酶： 1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。 分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。 ;Ⅱ型酶 1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。 识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。 许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在???ＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。 ;Ⅲ型酶 这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的。 ;Ⅱ型酶的基本特性 1. 在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。 2. 两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的 3. 因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。;核酸内切酶作用后的断裂方式 粘性末端 ：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。 具有3’-OH（ Pst1 ），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。 Pst1 EcoR1 5’CTGCAG 3’ 5’GAATTC 3’ 3’GACGTC 5’ 3’CTTAAG 5’ ;平末端 两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。 ;;同裂酶（isoschizomers) 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 Example: 限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) ，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。;同尾酶（isocaudamer） 指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。 杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。 一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。 BamHⅠ G GATC C BclⅠ T