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第三章 基因工程工具酶;应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列; ;3.1 限制性核酸内切酶;5’;;;?细菌的限制—修饰系统; 限制—修饰的酶学假说 酶切位点 不被修饰 酶切位点 被修饰 Methylation 限制性核酸内切酶;1968年，Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性 核酸内切酶;; 3.1.3 II型限制性核酸内切酶的特点 1、识别位点的特异性: 每种酶都有其特定的DNA识别 位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列（靶序 列）;;3、切割位点的规范性: 双链DNA被酶切后，分布 在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末 端或平末端的DNA分子）。;;;;;;练一练;;5、原核;3.1.5 限制性核酸内切酶的命名-;;?;;3.1.7 限制性内切酶识别序列出现的几率及; II型限制性核酸内切酶的切割位点是： A 识别序列内 B 识别序列1000bp以外 C 识别位点下游24－26bp处 D DNA分子任一位点 ;关于基因工程的叙述，下列哪项是错误的? A. 基因工程也称基因克隆 B . 只有质粒DNA可作为载体 C . 重组体DNA转化或转染宿主细胞 D. 需获得目的基因;某一重组 DNA 的载体部分有两个 BamHI 酶切位点。用 BamHI酶切后凝胶电泳上出现四条长度不同的带子，其长度总和与已知数据吻合，该重组分子插入片段上的 BamHI 酶切位点共有 A.4 个 B. 3 个 C. 1 个 D. 2 个;下列五个 DNA 片段中含有回文结构的是 A. GAAACTGCTTTGAC B. GAAACTGGAAACTG C. GAAACTGGTCAAAG D. GAAACTGCAGTTTC; 3.1.8 影响限制性内切酶活性的因素;;电泳;酶切操作注意事项;星活性（star activity）;导致星号活性的因素：1.??较高的甘油浓度（5% v/v）； 2.??酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为100U/μg）； 3.??低盐浓度（25 mM） 4.??高pH值（pH 8.0） 5.??存在有机溶剂（如二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等） 6.??用其他二价离子替代镁离子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）  以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些。 抑制星号活性的方法：1.??尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。 2.??尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。 3.??将离子浓度提高到100-150 mM（若酶活性不受离子强度影响）。 ;;;3.2 DNA连接酶;DNA连接酶 ：由大肠杆菌基因组DNA编码，以 NAD+作为能源辅助因子。只能连接粘性末端;DNA连接酶作用的特点; 是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链 环化起来。;DNA 连接酶连接的作用机制;;1. 黏性末端DNA片段的连接; 2. 平末端DNA片段的直接连接法 和末端加尾连接法;同聚物加尾法;;cDNA链的合成;衔接物缺点;DNA接头（adapter）连接法：;DNA接头;DNA接头连接法;1. 大肠杆菌DNA聚合酶I 2. Klenow片段;大肠杆菌DNA聚合酶I;; 大肠杆菌聚合酶Ⅰ的应用示例;5’ ;大肠杆菌DNA聚合酶I 发挥作用的三个条件;大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途; Klenow片段 Klenow片段大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生 的大片段酶分子，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→ 5 ′的 核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。 Klenow片段的主要用途;主要用途;② DNA 3’末端标记 在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。;; T4DNA聚合酶的特点 T4DNA聚合酶 从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它 和Klenow片段一样具有5′→3′的聚合酶活性和3 ′→ 5 ′的 核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性 高200倍。 特别是，T4DNA聚合酶还有第三种活力—取代反应： 如果反应体系中仅存在一种dNTP，这时T4DNA聚合酶就会表现出 3 ′→ 5 ′外切酶活力，从双链DNA的3′开始降解，直到露出 和缺乏的那中dNTP互补的碱基，然后就在此位置发生合成