电针“足三里”对大鼠脊髓背角内ERK12磷酸化水平影响.docVIP

电针“足三里”对大鼠脊髓背角内ERK12磷酸化水平影响 　　[摘 要] 目的：探讨针刺镇痛机理。方法：将动物随机分为5组；正常对照组、单纯电针组、福尔马林组、福尔马，林加同侧电针组和福尔马林加对侧电针组。造模方式为大鼠右足后垫皮下注射4％福尔马林溶液100μL。电针刺激“足三里”穴，疏密波，频率2～15 Hz，强度2～3 mA，持续30 min。1．5 h后麻醉处死动物，制片观察。结果：正常对照组脊髓后角浅层仅见个别腰段脊髓磷酸化ERK1／2(pERK1／2)阳性细胞(6．45±1．05)个；单纯电针组在电针同侧的脊髓背角有少量阳性细胞出现(14．07±3．19)个；福尔马林模型组的同侧脊髓背侧角浅层有大量阳性细胞被激活(26．57±4．93)个，主要分布于Ⅰ和Ⅱ0。层；模型加同侧电针治疗组阳性细胞数(20．79±5．21)个与福尔马林模型组比较有减少的趋势，但统计学差异无显著意义；模型加对侧电针治疗组的炎症侧脊髓背角的阳性细胞数(14．75±3．03)个较福尔马林模型组显著减少(P＜0．05)。结论：电针抑制脊髓后角ERK1／2信号分子的磷酸化，可能与其镇痛效应的发生机制有关。 　　[主题词] 针刺镇痛原理；电针；穴，足三里；脊髓／针灸效应；磷酸化酶磷酸酶／代谢十分明确。近年研究发现，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路的激活在炎性痛敏以及神经性疼痛的产生和维持过程中发挥了关键作用[1,2]。MAPK属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族，是胞外信号从细胞表面传导至细胞核内部的重要传递者，通过对转录因子磷酸化调节参与细胞反应基因的转录表达，或直接作用于胞浆底物。目前已至少发现MAPK的4个亚族：细胞外信号调节激酶(ERK1／2)、P38MAPK、C―JunN―末端激酶／应激―活化蛋白激酶(JNK／SAPK)和ERK5。其中，ERK1／2通过胞膜去极化和钙内流活化，由上游丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)激活，参与细胞的增殖分化和神经元的可塑性，例如长程增强效应、学习记忆和一系列应激后脑内神经元和胶质细胞反应[3]。最近一些研究报道ERK1／2磷酸化水平变化发生于伤害性疼痛通路，在不同的外周疼痛模型中均发现脊髓背角磷酸化ERK表达增加，而用其上游MEK的阻滞剂能减轻大鼠的痛觉过敏表现[4]。本研究旨在观察电针“足三里”对大鼠足底炎性痛刺激诱发的脊髓背角内磷酸化ERK1／2表达的影响，从细胞信号转导的角度探索针刺镇痛的机制。 　　1 材料与方法 　　1．1 动物分组 　　成年SD大鼠25只，雄性，体重0．25～0．3kg，由第四军医大学动物中心提供，许可证号：SCXK(军2002―005)。随机分为5组：福尔马林组，单纯电针组，福尔马林加同侧电针治疗组、福尔马林加对侧电针治疗组及正常对照组，每组各5只。 　　1．2 干预措施 　　对注射福尔马林制作急性炎性痛模型的动物，用40 g／L戊巴比妥钠(10 mg／kg)腹腔麻醉后，于大鼠右足后垫皮下注射4％福尔马林溶液100μL，造成右足底的炎性病灶。 　　电针刺激选穴和刺激方法：因在针刺镇痛中，选择与疼痛部位为同一或邻近脊髓节段的穴位可取得较好的镇痛效应[5]，且已有实验证实电针“足三里”可起到镇痛的效应[6]。故选取与足底炎性病灶邻近的“足三里”穴针刺。大鼠取穴参照《常用动物针灸穴位图谱》。电针使用参数参照相关文献[7]。大鼠“足三里”位于膝关节后外侧腓骨小头下约5 mm处。模型加电针治疗的两组在福尔马林造模后5 min进行针刺，其中模型加同侧电针治疗组于右侧“足三里”进针；模型加对侧电针治疗组于左侧“足三里”进针。单纯电针组动物未造模，麻醉后于右侧“足三里”针刺。用直径0．35 mm毫针直刺入穴位约7 mm深。WQ―10D1电针治疗仪的一根电极接于毫针末端，另一电极夹在电针同侧的大鼠耳郭上。采用疏密波刺激，频率2～15 Hz，强度2～3 mA，以大鼠电针侧肢体轻微抖动为度。针刺时间为30 min。 　　正常对照组，动物未造模，麻醉后右侧“足三里”进针，但不通电，30 min后去针。福尔马林组，仅造右足底炎性病灶，未予针刺。 　　1．3 取材和切片 　　福尔马林组造模后1．5 h经心脏灌流处死，其余各组于针刺后1 h经心脏灌流处死。先用100 mL生理盐水快速灌流以冲洗血液，然后用预冷的4％多聚甲醛400 mL灌注，先快灌200 mL，然后慢灌200 mL，共约1h。灌注完毕后取脊髓腰膨大段，在相同固定液中固定2h后，放人20％蔗糖溶液，4℃过夜。组织沉底后，用冰冻切片机连续切片，隔5张取1张，片厚50 pm。收集于冻存液中于-20℃保存待用。 　　1．4 免疫组织化学染色 　　从-20℃冰箱取出