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实验七 植物mRNA原位杂交技术 mRNA原位杂交技术的原理 原位杂交（in situ hybridization）是一种在细胞水平上研究基因表达调控的最直接有效的分子生物学技术。 RNA原位杂交是用同位素标记或非同位素标记的双链DNA或单链反义RNA探针对组织切片或装片的不同细胞中基因产物mRNA或rRNA进行原位定位。分布于细胞中的mRNA与反义RNA探针互补而杂交产生双链的RNA。标记在反义链上的同位素经放射自显影、非同位素经酶促免疫显色或免疫荧光反应，均可显示mRNA在植物组织细胞中的分布位置。用标记的有义RNA作探针，由于与细胞内的mRNA不互补而不能杂交，可以作为对照。 RNA原位杂交的操作流程 以组织切片和DIG标记RNA探针为例：材料固定与包埋→制片→质粒DNA线性化和DIG标记的体外转录（探针制备）→预杂交→杂交→杂交后处理→免疫反应→显色反应→封片观察。 一、材料固定和包埋 固定：固定是用固定剂杀死细胞，使细胞的原生质凝固，保持细胞原有的结构。采用的固定剂应穿透力强，能使细胞立刻致死，原生质全部凝固，同时不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色和观察。 脱水：如果材料含有水分，水与石蜡不能相溶，通常用酒精脱水。材料由水入酒精中，由低浓度酒精渐至高浓度酒精。通常由30%、50%、70%、80%到90%酒精，每次须经半小时左右，具体的时间由材料大小而定。 透明：材料脱水后，仍需除去酒精，脱酒精通常用二甲苯。 包埋：把材料包埋在石蜡里面，便于切片。 材料固定 简单固定液： 1、酒精：常用纯酒精或95%酒精作固定液。酒精穿透力强，固定时间常在1小时以内；70%酒精可作保存液。 2、福尔马林：即甲醛，固定用的浓度为4-10%。 3、醋酸：又叫冰醋酸。醋酸与水和酒精配成各种比例的溶液，浓度为0.2-5%，也常与其他固定剂配合使用。醋酸穿透性很强，单独使用，有使原生质膨胀的作用，故常与酒精，甲醛等合用，醋酸为固定染色体的优良固定液，因此，固定染色体的固定液中，几乎都含有醋酸 材料固定 混合固定液： 1、 FAA固定液：植物组织最常用的固定液。固定时间不受限制，并且固定后材料可以正常染色。配方：50%或70%酒精90毫升（软材料用50%酒精，硬材料用70%酒精），冰醋酸5 ml，福尔马林5 ml。 2、卡尔诺氏（Carnoys）固定液：多用于组织和细胞的固定，渗透力极快，一般情况下，固定根尖和花药只需40-60分钟。固定后用95%酒精冲洗，在组织不能立即处理时，需转入70％酒精中保存。配方1：15 ml乙醇和5 ml冰醋酸混合；配方2：30 ml乙醇，5 ml氯仿和1 ml冰醋酸混合。 3、纳瓦兴（Navaschjn‘s）固定液：植物制片技术中广泛应用。配方：75 ml 1%铬酸，5 ml冰醋酸和20 ml福尔马林混合。根据实验材料的种类，目前有很多的改良液，效果更好。 材料脱水 材料洗涤后，如果材料含有水分，水与石蜡不能相溶，通常用酒精脱水。材料由水入酒精中，由低浓度酒精渐至高浓度酒精。通常由30%、50%、70%、80%到90%酒精，每次须经半小时左右，具体的时间由材料大小而定。 材料可放在70％酒精中较长保存，但在高浓度酒精中不能过久。因为酒精能使材料硬化，过久则材料由硬而脆，切片时易于粉碎。 材料透明 材料脱水后，仍需除去酒精，脱酒精通常用二甲苯。材料由酒精入二甲苯，也需要渐次进行，先经酒精和二甲苯的混合液，再入纯二甲苯中，纯二甲苯须换一、二次才行。时间每次约半小时。二甲苯不仅脱去酒精，并且具透明作用，所以又叫透明剂。 材料包埋 埋蜡是把材料包埋在石蜡里面，便于切片。石蜡质地必须纯净，溶点通常在48-56 ℃范围内，以52 ℃的石蜡使用更为方便。将石蜡置陶瓷钵中加热熔化；在进行封埋的全过程中，石蜡的温度以高于溶点2 ℃为宜，温度低则石蜡凝固，温度过高则伤害实验材料。 在包埋之前需要对实验材料进行浸蜡。浸蜡需要渐次进行。一般先用石蜡和二甲苯的混合液浸蜡，再用纯石蜡换1-2次，每次时间视材料大小而定，通常每次半小时。 二、制片（12月3日） 切片： 1. 先将蜡块切成小块，粘固在小木头桩上。 2. 安装切片刀，调好角度和切口部位。 3. 根据需要调整切片厚度，进行切片。 展片：将切好的石蜡材料平展在玻片上，一般借助水将石蜡切片展开。 粘片：通过加热使切好蜡带平展在载玻片上。用滤纸吸去载玻片上多余水分，同时以记号笔在玻片上编号以确定材料方位，放入42℃温箱中烘干，约12小时。 粘片（载玻片的处理） 多数采用多聚赖氨酸作为粘贴剂，多聚赖氨酸常用PBS配制。 方法：用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度回升至室温（一般为18-26 ℃）。将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液中5-30分钟