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第三章 微生物酶 * * 酶是活细胞产生的一种生物催化剂。在酶的参与下，生物体内的新陈代谢才能有序进行。尽管人类在19世纪前后才建立起酶的概念，但酶的催化作用却很早就为人们的生活所利用。 1897年以后，Buchner发现酶的细胞外作用现象，从而导致了酶的商品化生产。 最初的商品酶制剂主要以动植物为原料提取，如从牛胃中提取凝乳酶、从胰脏中提取胰酶、从血液中提取凝血酶及从植物中提取淀粉酶等。 3.1 概 述 Takamine利用霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破。其方法甚至在今天仍被采用。 第二次世界大战以后，随着微生物培养技术、发酵工艺和设备的日臻完善，利用微生物来获得商品化酶制剂已形成规模化产业，并开辟了广阔的市场。 20世纪90年代以后，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，可以在微生物上得到表达。 由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，因此“基因工程+发酵工艺+先进发酵设备”可以算是酶工业的第三次飞跃。 3.2 微生物酶的开发 3.2.1 应用微生物来开发酶的优点 微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生产酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受限制地扩大，能够满足迅速扩张的市场需求。 微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且不同环境下生存的微生物都有其迥然不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。 3.2.2 微生物酶开发的一般程序 样品采集 菌种分离 初筛复筛 摇瓶实验 最佳产酶条件组合研究 微生物育种 物理诱变 化学诱变 分子改造 酶的制备 收集发酵液 收集菌体 胞外酶 胞内酶 破碎 酶学研究 产品 扩大 指导工业生产实践 保藏菌种 一、样品的采集 采样的目的决定采样地点的选择、采样方法及采样的数量。存在目的酶作用底物或潜在作用底物的场所是首选的采样地。 实例：生物工程中应用到的Taq酶就是来自于从美国黄石国家公园100℃硫泉中分离获得的水生栖热菌。 采样的另一个原则就是到特殊或极端环境中采集样品，从这些微生物中往往能获得新酶或具有特殊稳定性的酶种。 实例：为了获得产纤维素酶的目的菌，就可以到垃圾填埋场或长期堆放纤维材料的地方，甚至食草动物的消化道中采样。 菌种的分离是整个工作的第一个关键步骤。分离应注意以下几个问题： 分离培养基的确定。 分离培养条件的选择，如培养温度、湿度、好氧或厌氧培养等； 在分离的最初阶段一般不给予严密的培养条件，尽可能分离到尽可能多的纯菌种。 二、菌种的分离 三、菌种的初筛 菌种的初筛有两种方法： 用简单的定性反应进行初筛； 在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。 初筛的目的：就是要用最简单和最快捷的方法来对大量的待筛菌进行测试。 建立有效的初筛模型是最为重要的一个环节。 四、菌种的复筛 复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。在复筛阶段，酶活力测定方法的建立十分重要。 最后，应该指出，除了可以从自然界中分离获得目的酶产生菌外，也可以从已经保藏的菌种中筛选产酶菌种。这样做不仅可以节约大量的人力和物力，而且可以根据前人的资料和经验，了解产酶微生物的类别，然后有目的地加以寻找，搜集有关菌种或相类似的微生物，则可达到事半功倍的效果。 五、对复筛获得的菌株的要求 对于经过复筛之后获得的高产菌株还应在此阶段进行考察。 不能是致病菌。 所获菌株应不易变异和退化，不易感染噬菌体。 微生物产酶量高，生长繁殖快。酶的性质符合应用的需要，而且最好是产胞外酶的菌株。 产生的酶便于分离和提纯，得率高。 营养要求低。 六、最佳产酶条件的初步确定 1. 培养方式的确定——固体法；液体法 2. 最佳培养条件组合 3. 胞内酶和胞外酶 胞外酶具有以下一些优点： （1）分离提取容易，且不必破碎细胞，因而也就省去了去除核酸的工艺； （2）胞外酶的生产不受可获得生物量的限制，因而容易得到较高的酶产量； （3）胞外酶活性显现的最适条件与产酶菌株的最适生长条件往往一致。 与之相反，以胞内酶为商品酶生产的酶源，不仅生产工艺复杂，而且酶合成量的提高往往受“饱和”效应的限制，甚至给细胞带来毒性。 注意：并不是所有的酶都可找到其相应的胞外酶产生菌，少数一些酶就只能在微生物细胞内生成。比如葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、蔗糖酶、乳糖酶等。另外，用于分