cpgodn对hepg2细胞及其相关因子的作用研究word格式论文.docxVIP

中文摘要目的研究未甲基化CpG寡核苷酸（CpG-ODN）对肝癌细胞HepG2的作用：一方面包括CpG-ODN通过具有TLR9阳性表达（TLR9+）的人外周血单核细胞（PBMC）对HepG2的间接作用，另一方面包括CpG-ODN对TLR9+HepG2细胞的直接作用，以此对CpG-ODN在肿瘤免疫治疗中的安全性作出初步评价。方法主要包括三方面：1）提取含有CpG-ODN的质粒，用质粒CpG-ODN、多肽单独或联合刺激PBMC，之后与HepG2共孵育，分别提取两种细胞的总RNA，并进行反转录得到cDNA，设计合成MyD88、Caspase-8的PCR引物，以得到的cDNA为模版， β-actin为内参进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测MyD88、Caspase-8的表达情况；2）使用磷硫酰CpG-ODN刺激TLR9+细胞，即PBMC和HepG2，提取总RNA进行反转录得到cDNA，设计合成抗凋亡因子Bcl-xL、Bcl-2，凋亡因子Bid以及TLR9的PCR引物，以β-actin为内参进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测Bcl-xL、Bid、Bcl-2、TLR9的表达情况；3）使用磷硫酰CpG-ODN刺激HepG2，流式细胞仪检测细胞周期。结果1、质粒CpG-ODN能诱导与HepG2共孵育后的PBMC高表达MyD88，间接影响HepG2中MyD88、Caspase-8的表达；2、CpG-ODN对PBMC中Bcl-xL、Bid表达有一定影响，对HepG2中Bcl-xL、Bcl-2、Bid表达的影响较明显，即当CpG-ODN的浓度在0~3μM范围内升高时，HepG2 中抗凋亡基因Bcl-xL、Bcl-2的mRNA水平有降低趋势，凋亡因子Bid有增高趋势，抗凋亡因子与凋亡因子的比率减小；3、正常状态HepG2在0.5~2.5μM CpG-ODN作用下，细胞周期无明显变化；在2.5~25 μMCpG-ODN作用下，HepG2细胞周期中的G1期增大，S+G2/M期减小；在25~50 μM CpG-ODN作用下，G1 期减小，S+G2/M期增大；4、生长状态不良的HepG2在CpG-ODN作用下，凋亡率APO明显增大，且呈剂量-效应依赖性。结论TLR 信号通路中的关键接头分子——MyD88，该信号通路的激活可能是质粒CpG-ODN刺激PBMC杀伤肿瘤细胞的作用机制之一，此外PBMC杀伤HepG2的分子机制中可能涉及HepG2中Caspase-8的表达；CpG-ODN可能是通过调控Bcl-2家族成员表达而有诱导HepG2凋亡的趋势，这包括Bcl-xL、Bcl-2、Bid；在HepG2状态正常条件下，低浓度CpG-ODN（0.5~2.5μM）对HepG2 细胞周期的作用不明显，中浓度CpG-ODN（2.5~25μM）对HepG2的增殖有一定的抑制作用，高浓度CpG-ODN（25~50μM）有促进HepG2增殖的趋势；在HepG2状态不良条件下，CpG-ODN可以促进HepG2 细胞凋亡。关键词：CpG-ODN；TLR9；肿瘤；凋亡；聚合酶链式反应；流式细胞术AbstractObjective:TheobjectiveofthisstudywastoinvestigatetheeffectsofCpG-ODNon HepG2cells,includingtwoaspects,onewastheindirecteffectofCpG-ODNonHepG2 mediatedbyPBMC,andtheotherwasthedirecteffectofCpG-ODNonHepG2.Onthisbasis,wecanprovideapreliminarysafetyassessmentaboutCpG-ODNincancerimmunotherapy.Methods:Threeaspectsofthesemethods:1）TheplamidcontainingCpG-ODNwas extractedfromthebacterialculturebyusingEndo-freePlasmidMaxiKitandidentifiedwithenzymeshearingandagaroseelectrophotresis.PBMCswereactivatedbyplamidCpG-ODNaloneorincombinationwithpolypeptidesandtransferredtoco-incubatewithHepG2cells.ThenthetwokindsofcellwerepreparedtoextractthetotalRNArespectivelythatmusttobemaintainedat-80℃.MyD88andCaspase-8prim