bmi1通过抑制ink4aarf靶点促进胰腺癌发生的实验分析word格式论文.docxVIP

实验材料1.1 主要仪器试剂超净工作台（YZ-875,苏州）；酶标仪（TAKARA，日本）；荧光显微镜（OLYMPUS, 日本）；倒置显微镜（OLYMPUS,日本）；流式细胞仪（FACSCAN，美国）；低温高速离心机（德国）；PCR仪（德国）MTT(Sigma)；DMSO(Sigma) ；细胞凋亡检测试剂盒（凯基，中国）；血液/细胞/ 组织基因组DNA提取试剂盒（天根，中国）；大量DNA产物纯化试剂盒（天根，中国）；PCR Master Mix(2×)(Fermentas)；琼脂糖（西班牙）；氢醌Hydroquinone(Sigma)；亚硫酸氢钠Sodiumhydrogensulfite(Sigma)；逆转录试剂盒（TOYOBO）；Trizol溶液（美国GIBCO）；30%丙烯酰胺溶液（上海生工）；Tris-Base(Sigma)；10%SDS(Sigma)；Mouse BMI-1 antibody（Santa, sc-81201）；Mouse P16 antibody（Santa,sc-71804）；Mouse GAPDHantibody（ProMab,Mab-2005079）；GoatAnti Mouse IgG/HRP1.2 慢病毒载体由上海吉凯基因基因技术有限公司合成；根据Bmi-1的编码序列设计并合成靶向沉默Bmi-1 的siRNA 序列5-ATGAAGAGAAGAAGGGATT-35-AATGGACATACCTAATACT-3,将其克隆至病毒载体pSuper-retro，构建编码Bmi-1 siRNA的病毒载体pSuper-retro-Bmi-1 对照组为pSuper-retro-GFP载体。1.3 细胞株人胰腺癌PANC-1细胞由本室保存，细胞用含10%新生牛血清的DMEM高糖培养液在37 摄氏度，5% CO2的细胞培养箱内培养，用0.25%胰酶消化传代。统计学方法用SPSS 5.0 软件卡方检验或者方差检验，取P0.05 有统计学意义。RT-PCR条带用Quantity one 软件分析第一部分RNAi沉默Bmi-1基因效率确定PcG(Polycomb Group, PcG)首先是在果蝇中发现的，目前已经发现了30-40种PcG 基因，其编码产物称为PcG蛋白家族。该家族结构高度保守，且通过不同的信号通路参与调节细胞自我更新、细胞衰老和永生化、转录等生物学行为。Bmi-1 是属于Polycomb蛋白家族重要的细胞增殖调控基因，属于原癌基因。研究显示Bmi-1对于造血干细胞的自我更新过程是必需的，同时也参与了许多其他细胞的更新、增殖过程。已有报道指出Bmi-1在胰腺癌PANC-1细胞中高表达。本研究构建了反义Bmi-1的病毒载体pSuper-retro-Bmi-1对照组为pSuper-retro-GFP载体并转染PANC-1 细胞，运用显微镜下荧光观测、MTT、Western-Blot 法来确定转染效率为后续实验之基础。1 方法及步骤1.1 细胞复苏与传代深低温冰箱中取出冻存的细胞系PANC-1，迅速置37℃水箱解融，离心1000rpm×5min，弃上清，DMEM 培养基洗涤一次后加含10%血清的DMEM 培养基吹打为细胞悬液，接种于细胞培养瓶中，放细胞培养箱中培养（37℃，5%CO2），第二日更换培养液，细胞覆盖瓶底达75-85%时传代。MTT法原理及步骤①MTT原理:MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶标仪在570nm/490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT不会有反应。②接种细胞：取对数生长期细胞，用含10％血清的培养液配成单个细胞悬液，每孔1000 个细胞接种到96 孔板，每孔体积100ul，边缘孔用无菌PBS填充。③5%CO2，37℃孵育待细胞贴壁后加入MOI=60 的相应病毒液后使每孔体积为200ul，设5个复孔分别培养0h，24h，36h，48h，96h。设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液孔。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。④每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150ulDMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，最后以时间为横坐标，吸光值为纵坐标