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生物样品中生物大分子的分离纯化 * 生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子，结构具有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一定顺序和方式连接而形成的多聚体。常见的生物大分子包括蛋白质(包括酶)、核酸、多聚糖等。实际上生物大分子的特点在于其表现出的各种生物活性和在生物新陈代谢中的作用。 什么是生物大分子？ * 生物大分子的理化性质 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 固态时和冻干时的稳定性。 物理性质： 分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、 离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。 化学性质： 对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 对其他生物分子的特殊亲和力等。 * 生物大分子分离纯化的特殊性 生物材料的组成复杂，种类极多。 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤多，流程长。 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 * 生物大分子分离与纯化基本步骤 一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存 * 一、前期准备 （一） 明确目的和要求 （二） 了解的生物大分子的物理化学性质 溶解性、稳定性、亲和力、缓冲液、pH （三） 生物材料的选择和预处理 * （三）、生物材料的选择和预处理 从工业角度考虑 从科研角度考虑 选材时，注意材料的季节性，动物的生理状态，微生物的生长期，选择的材料应含量高、来源丰富、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。 材料选定以后要预处理 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。 植物要先去壳、除脂。 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。 生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。 * 生物大分子分离与纯化基本步骤 一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存 * 二、组织与细胞破碎 1、机械破碎法 高速组织捣碎机：利用高速旋转的叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。 处理材料量较大时，使用之。 匀浆器：匀浆器用来破碎那些比较柔软，易于分散的组织细胞。科研上若材料处理量少，可使用匀浆器。 研磨器 * 2、物理破碎法： 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。 二、组织与细胞破碎 * 二、组织与细胞破碎 3、酶学破碎方法 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞使细胞壁自行破裂，内含物被释放出来。 * 二、组织与细胞破碎 4、化学破碎方法： 通过化学试剂的作用使细胞膜的透过性改变。 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。 5、其它方法 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 * 生物大分子分离与纯化基本步骤 一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存 * 三、初步分离提取 影响生物大分子提取的因素主要有： 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； 由固相扩散到液相的难易； 溶剂的pH值和提取时间等。 通常极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂； 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质