生物学的几个阶段.ppt

mRNA的分离有许多种方法，例如化学的方法，物理的方法（如差速梯度离心法）等。有的还可以利用真核生物的mRNA具有的poly A尾巴进行亲和层析法分离mRNA。有的则采用几种方法联合使用，其总的目标就是获得纯度高、得率高的有活性的mRNA。  在取得专性的mRNA后，接下来就是将mRNA通过反转录酶合成杂种DNA链（DNA-RNA分子），在碱（KOH）作用下水解RNA链，然后经DNA聚合酶作用再合成第二条DNA链，即形成双链cDNA分子，将双链cDNA插入载体后形成重组体，并导入细菌中，随细菌的繁殖而扩增和克隆，形成cDNA文库 二、基因组文库的构建 基因文库（gene library）：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上，然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为某种生物的基因文库。同一定义也适用于线粒体或叶绿体ＤＮＡ的基因文库。由于制备ＤＮＡ片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的ＤＮＡ片段即可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近ＤＮＡ顺序。 基因文库的构建就是利用所谓的“鸟抢法”，使基因组的DNA片段随机地插入适当的载体中，引入细胞进行大量繁殖而构建的。  用于构建基因文库的片段的产生大致有两种方法，一是用限制性内切酶完全消化基因组DNA，这个方法有两个特点。第一是假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中，给研究带来一定的困难。第二，一般常用的限制酶大多识别六个bp序列，切割DNA所产生的片段的平均大小相对比较小（约4kb即46＝4096bp），因此整个基因文库要含有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。虽然可以用限制酶进行部分消化，产生约20kb的片段，但这种方法必须掌握好酶解的条件。 用于制备基因文库的随机片段的另一种方法是采用机械随机切割。这种方法可以制备大片段的DNA（用噬菌体λ作载体约20kb，以cosmid作载体约45kb ），从而克服上述的两处缺点。但是这种方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经过末端修复，人工制造接头等手续才能与载体ＤＮＡ进行连接。 用于基因文库构建的载体常用噬菌体λ或cosmid载体，因为它们的容量比较大，可克隆大片段的DNA。虽然cosmid载体比λ载体的容量大，但由于文库的保存（cosmid载体在E.coli中， λ载体在噬菌体中） λ比cosmid容易，因此λ载体用的更多些。 基因组文库的克隆数：由于基因文库的DNA片段是随机克隆的，因此要保证任何一个基因在文库内都能找到，基因组文库的克隆数量必须达到一定的数量。1975年Clarke Carbon提出一个计算公式： ln(1-P) N= ln(1-L/M) P：任一基因在文库中出现的概率 L：克隆片段的平均大小 M：基因组的大小 例：人的基因组大小为3x109bp，克隆片段的平均大小为19kb，P=0.99。N=7.3x105，即该文库的克隆子数必须达到73万。 三、差异文库（differential library）的构建 差异文库又称差示文库、扣除文库（subtracted library）。用于克隆不同组织细胞或同一组织细胞处于不同功能状态下基因表达差异的cDNA文库。这种方法特别适用于克隆在特定细胞中表达的基因、在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、在特定发育阶段表达或参与发育调节的基因等。它的优点在于不需要任何有关目的基因的核苷酸序列信息，只要求有两种差异表达的细胞群体。 正常组织的mRNA 异常组织的mRNA 杂交 mRNA-cDNA +某些单链cDNA 羟基磷灰石分离单链cDNA