情绪对大鼠脑出血CNS损伤修复精品.pptVIP

邹鹏 孙普阳 情绪对大鼠脑出血CNS损伤修复的影响 Living in Passion The Effect of MOOD Purpose 情绪对大鼠大脑出血修复的影响 1 掌握GAG-43蛋白表达与神经损伤修复之间的关系 2 Principle 在应激状态下，交感神经一肾上腺髓质系统(SAS)和下丘脑一垂体一肾上腺皮质(HPA)轴兴奋，血清儿茶酚胺(CA)和肾上腺糖皮质激素(GC)含量上升。而持久的情绪应激导致机体神经内分泌免疫功能紊乱可能加速大脑损伤神经元的凋亡，从而影响CNS损伤的修复； 内啡肽类激素如五羟色胺对于大脑具有兴奋作用，产生愉快的感觉，音乐刺激可促进大脑内啡肽的分泌，可以以此模拟积极情绪。通过对大鼠进行不同的情绪处理，来研究情绪对大鼠脑出血损伤修复的影响; 通过对大鼠脑内神经再生标志物GAP-43蛋白表达水平的检测，可确定受损CNS修复的程度及神经元的再生情况。 Materials 实验对象 体重接近，成年Wistar 大鼠 实验试剂与器材： 手术器械一套 音乐播放装置 Western blotting相关器材 Experimental Procedure 大鼠脑出血模型的建立 模型筛选分组 A B 对各组大鼠的恢复情况检测 D 对各组大鼠进行相应情绪处理 C 脑出血模型建立 大鼠固定 1 将大鼠用10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉,俯卧位固定于立体定位仪上,使上门齿钩平面比耳间线平面低2. 4mm,这样大鼠前囟和后囟在同一水平面上。 2 头皮正中切口暴露前囟及冠状缝,取前囟点右旁开3.5mm,后0. 2 mm定点深达硬脑膜表面，剪断鼠尾取血50 ul将未肝素化的血液以25 ul /min速度推进尾壳核,留针约2 min,缓慢出针 3 术后局部喷洒庆大霉素,用牙科水泥封闭颅骨创口,缝合头皮,局部皮肤采用碘酚消毒,防止局部感染影响指标观察。 脑出血模型建立 术后缝合修复 筛选成功模型分组 Berderson神经体征评分法： 轻抓尾巴,提起高于桌面10 cm,正常大鼠前爪伸直 0 point 无神经功能缺损 1 point 脑部病变对侧腕关节、肘关节屈曲,肩内收屈曲 2 points 上述体征+向麻痹侧推阻力下降 3 points 活动时向麻痹侧打圈(呈追尾状) 分组 愤怒刺激组 音乐安抚组 空白对照组 空白对照组： 放入代谢笼内，常规喂养不做处理。 沉默组： 另取20只做开颅处理，但不注射自体血损伤，后续工作同模型大鼠方法同空白 愤怒刺激组： 把愤怒模型组大鼠单独放入代谢笼内，另外随机放进一只入侵鼠，用纱布包裹止血钳钳夹入侵鼠的尾巴，入侵鼠被激惹，对模型组大鼠发起攻击，双方互相撕咬、对峙，产生愤怒心理和行为，每天刺激时间为20min，连续4周。最后入侵鼠丢弃不用。 分组处理 音乐安抚组： 将安抚组模型放入代谢笼内，每天给予音乐刺激20min，连续4周。音乐以优美舒缓的轻音乐为主。 恢复情况检测 (1)Berderson神经体征评分法： 轻抓尾巴,提起高于桌面10 cm,正常大鼠前爪伸直 0 point 无神经功能缺损 1 point 脑部病变对侧腕关节、肘关节屈曲,肩内收屈曲 2 points 上述体征+向麻痹侧推阻力下降 3 points 活动时向麻痹侧打圈(呈追尾状) 0分 1分 2分 3分 平均值U1 空白组 沉默组 音乐组 愤怒组 恢复情况检测 (2)Western blotting检测出血侧GAP--43的表达： 脑组织加裂解液匀浆后，离心取上清，应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配12％分离胶行蛋白SDS—PAGE变性电泳，电泳结束后，将蛋白电转印至NC膜：1％脱脂奶粉封闭1 h；加兔抗GAP-43抗体(1：1000)4~C过夜；TBST洗膜3xlO ；HRP标记羊抗兔I gG(1：1000)室温孵育2 h；TBST洗膜3×10 ，ECL化学发光法显影。实验重复3次。采用ImageMaster(r)VDS凝胶成像及分析系统，于可见光下采集底片上的蛋白条带图像，通过与相应B—actin条带密度比较．计算各条带密度相对值，然后取组内平均值，记为U2。 (3) 各组大鼠脑组织形态学的光镜观察： 过量麻醉,迅速开胸暴露心脏,从左心室插管至升主动脉根部,在右心耳处剪开一小口做出口。经麻醉鼠的左心室顺序灌注4℃生理盐水和4%多聚甲醛/0. 1MPB各约200 ml。4℃生理盐水200 m l快速灌注, 之后稍减慢灌注速度冲洗至流出的血水变淡后,换4%多聚甲醛200 m l快速灌注,之后稍减慢灌注速度继续固定灌注,待肝脏及肢体变硬后断头取脑。距注射针孔前后各约2