杨玲《细胞与遗传实验》实验四-2016.pptVIP

细胞与遗传实验 杨 玲 细胞与遗传医学系 上一周实验结果 缺糖或DDP诱导细胞凋亡是否经由Bax 构象改变？ Control GD DDP20 DDP40 DDP60 Conclusion 缺糖损伤和顺铂均可通过诱导Bax构象改变诱导PC12细胞凋亡，降低细胞活力 传代培养细胞染色体标本的制备 原 理 在细胞的生长周期中，中期染色体的长短、大小、恒定性正适合对其进行分析、研究。 因此利用人工的方法，使细胞分裂处于中期而不向后期转化，并收获细胞，经处理，制片后观察分析。 器材与试剂 培养箱、普通光学显微镜、离心机、水浴箱、天平等。 试管架、刻度离心管、滴管和滴头、酒精灯、冰载玻片等。 器材与试剂 Hela细胞 含10%胎牛血清DMEM 秋水仙素（10微克/毫升） 0.075MKcl（低渗液） 固定液（甲醇/冰乙酸3:1） 操 作 1、细胞培养 2、秋水仙素处理：终止培养前4h加秋水仙素（终浓度为0.07 ug/ml），混匀，37℃继续培养。 3、收集细胞：胰酶消化细胞，用培养液将细胞收集到离心管中，1500r/min离心，10min。 5、低渗处理：弃上清，加8ml 0.075M KCl溶液，混匀，置37℃水浴 20min。 操 作 6、预固定 ：低渗处理后，加1ml固定液混匀，1500r/min离心，10min。 7、固定 ：弃上清，加8ml固定液，混匀，室温静置15min，1500r/min离心， 10min。 8、制备细胞悬液 ：弃上清，视细胞数量多少加适量固定液制成细胞悬液。 9、制片 ：取细胞悬液2-3滴，滴于冰玻片上，并迅速吹片，酒精灯火焰烤干。 10、烤片： 37℃ 14天---G显带。 注意事项 胰酶消化细胞的时间一定要控制好 秋水仙素的浓度及处理时间很重要。 低渗液的浓度与处理时间应掌握好。 固定液应临用时新鲜配制，固定时一定要彻底打匀。 结果 人 结果 猴子 微 核 检 测 原 理 环境中有害物质可导致细胞中染色体或纺锤体的损伤，产生的染色单体或无着丝粒片断染色体在细胞分裂末期滞留于子细胞胞质中，形成微核。 原 理 本实验选用培养细胞，用顺铂作诱导剂（射线、环磷酰胺等） ，促使细胞中染色体断裂，产生微核。 微核经Giemsa染色后呈紫红色，胞质被染成淡灰蓝色。 目的 观察微核的形成（20umol/l， 40umol/l顺铂） 细胞对数期加顺铂（终浓度20umol/l，40umol/l）,24小时后检测 器材与试剂 显微镜、载玻片、染色缸、滴管等 培养细胞（小盖片） 甲醇固定液 PBS（pH7.4） Giemsa应用液（临用现配） Giemsa原液：PBS＝1：9混合而成。 操 作 培养细胞（小盖片）——加顺铂——PBS洗涤3次——甲醇固定6min——Giemsa染色10min——自来水洗涤——显微镜下观察——计数 微核的计算 先用低倍镜粗检，后用高倍镜，选择细胞分布均匀，细胞无损，着色适当的区域，计数。 每张玻片计数100-200个细胞，按“1‰”计算微核的出现率，微核计数以“细胞”为单位，即一个细胞中出现2个或2个以上微核时，只按“1”计算。 结 果 微核大多数呈单个圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色。 注意事项 正确掌握微核的形态特征，避免假阳性。 以有核细胞形态是否完好作为判断制片优劣的标准