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基因决定生物的性状 基因: 携带特定信息的核酸序列 中心法则:DNA RNA 蛋白质 双螺旋结构要点： 四种脱氧核苷酸以磷酸二酯键相连，形成核苷酸链； 两条核苷酸链相互平行，方向相反，结合在一起，形成一个双链的右手螺旋分子； 磷酸核糖骨架位于双螺旋分子的外侧，带有大量的负电荷，是亲水的，碱基位于分子的内部，是疏水的； 位于两条链上的碱基，按A=T，C=G的原则，通过氢键相结合，是维持DNA分子结构的主要作用力。 DNA分子的复制是半保留的。 认识基因: 决定特定性状的基因是什么?-基因克隆 这个基因如何决定性状?-基因功能分析 上述知识如何应用?-诊断，治疗，治药分析。 基因工程的诞生 理论准备：中心法则 技术准备：工具酶（RE，连接酶，RT）；载体；工程菌。 1972，Berg：SV40+Lamda 1865 1865 一、核酸的分离 质粒DNA的分离； 噬菌体DNA的分离； 哺乳动物细胞DNA的分离； RNA和mRNA的制备。 二、核酸的电泳 限制性内切酶的类型 II型RE的基本特点 切割位点序列旋转对称； 识别位点长度4-8 bp；44=256；46=4096；48=65536 三种末端； 同裂和同尾酶。 命名： 属名头一个字母，种名头两个字母；Escherichia coli：Eco；Haemophilus influenzae：Hin 第四个字母是株或型；Hind（Rd）； 第五位是罗马数字，表示第几个修饰系统（HindIII）； 影响RE活性的主要因素： DNA的纯度； DNA的甲基化程度； 温度； 缓冲液成分（DDT，BSA）。 DNA多聚酶的活性 5’?3’合成活性； 5’?3’外切活性； 3’?5’外切活性。 用途： 扩增DNA样本； 标记DNA探针； 合成cDNA第二链； 测序。 连接酶：把基因缝在一起 其它工具酶： 碱性磷酸酶； RNA多聚酶； S1核酸酶； DNaseI。 质粒载体 复制特性：松弛和非松弛；穿梭质粒；质粒不相容性（复制阻遏蛋白）； 构型。 常见质粒：pBR322；pUC；pGEM 类型：克隆，测序，表达。 哺乳类细胞表达载体 pLXSN反转录病毒表达载体 五、核酸的加工厂：工程菌 不具致病性； 不会接合； 培养简单； 表型和基因型较为清楚。 克隆的分离和鉴定 原核：1/药物抗性基因 5/选择性翻译 2/显色反应 6/捕获性翻译 3/原位杂交 7/免疫化学 4/DNA内切酶片段的长度 8/DNA顺序分析 真核：选择培养基 CHO-dhfr- 细胞 重组子筛选 快速细胞破碎 Alpha互补； 菌落原位杂交。  ?-半乳糖苷酶基因 ?-半乳糖苷酶 X-Gal(白色) 蓝色化合物 Alfa互补 七、基因转移技术 原核生物：转化（氯化钙），转导，电穿孔。 酵 母：转化（醋酸锂），电穿孔，交配。 哺乳动物：转化（磷酸钙），脂质体，电穿孔，病 毒。 八、基因表达 原核宿主(E.coli)表达真核基因或原核基因 需要的基本元件： 1.完整的编码基因，无内含子，5’有SD序列，ATG，3’有终止信号 2.原核启动子：控制基因表达(如PL，PR)，SD顺序 3.信号肽编码顺序：分泌表达产物 局限性： 1.无糖基化和组装二硫键等翻译后加工系统 2.无剪切内含子等转录加工系统 真核细胞基因表达 真核宿主表达系统的基本元件： 1.编码基因可含内含子 ， 5’ Kozak序列，ATG ， 3’终止和加尾信号 2.真核启动子: 如 SV40 ，CMV ，LTR 3.信号肽 4.筛选基因的转录单位 九、DNA文库 核酸检测技术 pH； 温度； GC含量 探针标记 双链DNA：随机引物，PCR，缺口平移， 末端标记。 oligDNA：末端转移。 RNA：体外合成。 随机引物 缺口平移（nick translation） 末端标记 5‘端末端转移标记 标记单链RNA探针 核酸杂交技术 DNA印迹杂交； RNA印迹杂交； 斑点杂交；