现代光分析-6 标记方法讲解材料.pptVIP

第四章 荧光法在生物分析中的应用;Fluorescence Probes in Bioanalysis ;蛋白质、核酸、多糖的荧光标记;Fluorescein;荧光素也存在一些缺点如荧光素共轭体不稳定, 荧光测试仪的强激光, 使之发生不可逆转的光漂白,导致荧光信号的迅速下降。荧光素在水溶液中以离子形式存在, 吸收及荧光性质易受pH值影响。与标记物共轭连接后, 易发生猝灭。;Rhodamine 6G (555 nm);例三;1. Amine-Reactive Probes fluorescein-5-isothiocyanate (FITC Isomer I) ; fluorescein-6-isothiocyanate (FITC Isomer II) ; Oregon Green? 488 carboxylic acid ; Rhodamine Red?-X, succinimidyl ester ; 4-dimethylaminoazobenzene-4-sulfonyl chloride (dabsyl chloride) ; Texas Red? sulfonyl chloride ;Spectra — Texas Red-BSA conjugate Absorption and fluorescence emission spectra of the Texas Red conjugate of bovine serum albumin (A-23017) in pH 7.0 buffer. ???????????????????????????????????????????????? ;Figure 1.39 Normalized fluorescence emission spectra of goat anti–mouse IgG antibody conjugates of fluorescein (FL), tetramethylrhodamine (TMR) and the Texas Red (TR) dyes, shown by dashed lines (---), compared to goat anti–mouse IgG conjugates of BODIPY FL, BODIPY TMR and BODIPY TR dyes, respectively, shown by solid lines (—). ;Figure 1.23 Comparison of the fluorescence spectra of the Alexa Fluor 680 and Cy5.5 dyes. Spectra have been normalized to the same intensity for comparison purposes.;Cy3 and Cy5 are reactive water-soluble fluorescent dyes of the cyanine dye family.（花青染料） 1989 ;;;;标记方法;混合酸酐法： 偶联物一方的羧基与氯甲酸异丁酯反应，形成混合酸酐。这是一种非常活泼的中间体，它能与氨基化合物反应形成酰胺键。 ;戊二醛法 ：戊二醛是一个双功能试剂，它的二个醛基能分别与标记化合物及被标记物的氨基形成Schiff键。;过碘酸法； 此法的必要条件是偶联物一方含糖，另一方含氨基。糖的羟基被氧化成醛基，然后与氨基作用形成Schiff键。 ;N—羟基琥珀亚胺活化法 ：不少抗原含有 羧基，可通过N—羟基琥珀酰亚胺活化，在与氨基化合物偶联。 ;琥珀酸酐法： 偶联物一方的羟基与琥珀酸酐反应，得到一个琥珀酸半酯，通过这个带羧基的中间体，与氨基形成酰胺键。 ;O—（??甲基）羟胺法： 抗原的酮基（或引进的酮基）与O—（羧甲基）羟胺反应，产生O—羧甲肟衍生物，这个中间产物的羧基与另一化合物的氨基结合。 ;重氮化法 ；芳香胺的重氮盐能以蛋白质的酪氨酸残基上的酚羟基的邻位反应，形成偶氮化合物。 ;2. Thiol-Reactive Probes ;????????Reaction of a thiol with an alkyl halide. ;;标记纳米粒子;三、核酸的荧光分析;;标记寡核苷酸;;分子灯标（Molecular Beacon）;分子灯标 （Molecular Beacon） 是一种由寡聚核酸形成的发夹型分子。;分子信标这一荧光信号传导机制是基于荧光能量转移基础上的。当两个基团的距离在1～10 nm ,且能量给体(荧光基团) 的发射光谱与能量受体(猝灭基团) 的吸收光谱有较大程度的重叠时,则可发生荧光