6. 荧光分光光度法培训资料.pptVIP

第6章.荧光分光光度法;6.1 概述;荧光蛋白质;;;荧光染料 ;荧光增白剂 ;单重态 所有电子自旋都配对的分子的电子状态。 大多数有机物分子的基态是单重态。 当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。; 三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。;S2;6.2.2.3 激发态→基态的能量传递途径;分子去活化过程及荧光的发生 ;;;6.2.2.4 分子荧光的类型;;;;6.2.3 激发光谱与荧光光谱;;;3.荧光光谱的特点： ①斯托克斯位移（Stokes shift)。与激发光谱相比，荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处； ②荧光光谱与激发波长无关。无论用λ=250和350nm作激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同； ③吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称。;6.2.4 荧光量子产率与分子结构;2.分子结构与荧光的关系;共轭结构与荧光的关系;分子结构与荧光;（3） 刚性平面结构;联二苯 φ= 0.2;刚性结构和共平面性与荧光的关系;刚性结构和共平面性与荧光的关系;分子结构与荧光; 与?体系作用小的取代基影响不明显： －SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R。; 取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光:;影响荧光的外界因素;影响荧光的外界因素;影响荧光的外界因素;pH 2;影响荧光的外界因素;影响荧光的外界因素;例：猝灭剂（quencher）的影响;溶液的荧光;2. 荧光分光光度计;单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器。 光源：高压汞灯、氙灯 检测器：光电倍增管;激发光源 要求发射强度大,波长范围宽,而且在整个波长范围内强度一致.常用高压汞灯和氙弧灯. 滤光片和分光器 干涉滤光片;分光器多采用光栅 样品室 样品室由样品池及样品转换器组成.其中样品池用石英或低荧光的玻璃材料. ;发射单色器 用于选择投射到检测器的荧光波长。 检测器 荧光或磷光的强度较弱，要求检测器灵敏度高。精密的荧光光度计采用光电倍增管为检测器，将转入的光信号转变为电信号，并将其放大，由记录器记录荧光强度。 ;6.3.2 荧光分析方法特点及应用;2．荧光分析法的灵敏度 比吸光法高得多，更适合于低浓度物质的分子。 这???种方法在灵敏度方面的差别主要是由于同浓度相关的参数的测量方式不同。;;; 一般情况下，多采用相对灵敏度来表示。相对灵敏度是以喹啉硫酸氢盐的0.05mol/L硫酸溶液为标准，并定为1，然后与相同浓度荧光物质的荧光强度比较，可求该物质的相对灵敏度。 ?;;?3.? 荧光分析法的选择性 很多分子在紫外可见区有吸收，但其中只有一部分能再发射荧光或磷光，故荧光法固有干扰很少，选择性较好。 ;1.无机化合物 很多金属（除铀盐等）和非金属可同有机化合物形成荧光配合物，测量发射的荧光可定量分析。荧光法可测元素：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Pb、Rh、Ru、S、Se、Sb、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn和Zr等。还有一些无机离子如氟和氰离子等能使其它物质的荧光由于熄灭效应而减弱。据此可测氟和氰等离子的浓度。 ;; 2. 很多有机化合物可同无机阳离子形成荧光配合物，一般都具有苯环以及二个以上能同金属离子螯合的配位基团。下面是四种最常用的荧光试剂的结构： ; 这些荧光试剂都具有π电子系统。激发和发射过程同π-π*跃迁有关。这种跃迁常产生宽的无精细结构的荧光峰。 ;3.;;举例— 痕量3,4-苯并芘的测定: ;;举例二 1,3-环己二酮-甲醛作为荧光衍生试剂荧光分光光度法测定氨苄西林钠;;荧光和化学发光检测仪 ;可获得三维光谱图的仪器;本章作业思考题