翘嘴红卸精原干细胞的分离培养及鉴定-江苏农业科学.PDFVIP

江苏农业科学　２０１５年第４３卷第６期 — ２０９— 曹　访，刘　莉，采克俊，等．翘嘴红 精原干细胞的分离培养及鉴定［Ｊ］．江苏农业科学，２０１５，４３（６）：２０９－２１１． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１５．０６．０６９ 翘嘴红 精原干细胞的分离培养及鉴定 １，２ ３ １，２ １，２ １ 曹　访 ，刘　莉 ，采克俊 ，叶金云 ，卢中玉 （１．浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室／湖州师范学院，浙江湖州３１３０００； ２．湖州师范学院，浙江湖州３１３０００；３．浙江省淡水水产研究所，浙江湖州３１３００１） 　　摘要：通过制作、观察翘嘴红 （Ｅｒｙｔｈｒｏｃｕｌｔｅｒｉｌｉｓｈａｅｆｏｒｍｉｓ）各生长阶段的精巢切片，确定翘嘴红 精原干细胞最佳 分离时间。采用两步酶消化法分离其精原干细胞，并进行体外初步培养研究，最后通过碱性磷酸酶染色、干细胞标志 基因Ｏｃｔ－４ＲＴ－ＰＣＲ扩增进行鉴定。结果显示：７月龄翘嘴红 精巢为分离精原干细胞的最佳时期，所分离的精原 干细胞符合干细胞的形态、增殖及表达特征，且细胞碱性磷酸酶染色呈阳性，支持细胞碱性磷酸酶染色呈阴性，Ｏｃｔ－４ 基因表达呈阳性。 　　关键词：翘嘴红 ；精原干细胞；分离培养；标志基因 　　中图分类号：Ｓ９１７　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１５）０６－０２０９－０３ 　　精原干细胞（ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＳＳＣｓ）具有自我更 Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公 盒购自碧云天生物技术研究所； 新及分化的潜能，是动物体内唯一能传递遗传信息的干细胞。 司；ＲＮＡ酶抑制剂、Ｍ－ＭＬＶ反转录酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司； ＳＳＣｓ起源于原始生殖细胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌｇｅｒｍｃｅｌｌｓ，ＰＧＣｓ），存在 Ｔａｑ酶、ＤＮａｓｅ 、ｐＭＤ２０－Ｔ载体、Ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）１５等购自大连 Ⅰ 于动物的睾丸或者精巢中，是雄性动物精子发生的前体细 宝生物工程公司；其他试剂均为国产分析纯。 ［１］ 胞 。ＳＳＣｓ在医学、畜牧生产学等领域应用前景极为广阔， １．２　方法 如探究精子的发生机制、治疗雄性不育及制作转基因动物等。 １．２．１　翘嘴红 精巢石蜡切片的制作　取各年龄段翘嘴红 当前对ＳＳＣｓ研究多集中在体外分离、培养、增殖、诱导分化、 精巢，用Ｂｏｕｉｎ氏液固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡 ［２－３］ ［４－５］ 移植等方面，涉及的物种主要包括小鼠 、大鼠 、禽 包埋，厚度７ ｍ连续切片，Ｈ．Ｅ染色，中性树胶封片后显微 μ 类［６－７］、灵长类等，关于鱼类 ＳＳＣｓ研究相对较少［８－１０］。研究 镜下观察、拍照［１２－１３］。 显示，鱼类ＳＳＣｓ细胞相较哺乳类动物及禽类具有更强的可塑 １．２．２　翘嘴红 精原干细胞的分离与培养　无菌条件下收 性，在一定条件下不但可以分化为精子，甚至可以分化发育为 集８～１０尾７月龄翘嘴红 精巢，用含有双抗的ＰＢＳ漂洗３