[高三理化生]PCR技术.pptVIP

第七章 聚合酶链反应（ polymerase chain reaction PCR） 重点：PCR的基本原理及过程。 难点：PCR的优化条件及PCR技术的发展。 基本要求： 掌握PCR的基本原理及在医学上的应用； 熟悉PCR的优化条件； 了解PCR技术的发展。 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增技术，即体外试管内DNA的扩增，以高特异性、高灵敏度、高效率及忠实性等特点，在生命科学研究领域产生着巨大的影响。 该技术于1983年由美国PE－Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人发明。该技术在基础研究、临床医学、法医学、考古等方面有重要的应用价值，并对分子克隆、DNA序列分析等分子生物学技术的发展给予巨大的推动。 PCR技术是方法学上的一次革命，被誉为生物学及医学研究的一个里程碑。 一、PCR的基本原理 PCR技术实际上是DNA的体外扩增技术。 其原理类似于DNA在体内的复制过程。 只要提供一个合适的条件――模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、四种dNTP原料和合适的缓冲液体系，在一定的温度下，经过重复的过程，就可以完成DNA的体外合成。 PCR反应是一个重复进行的DNA复制过程，需要重复进行：模板的解链、引物与模板的结合（粘合）、DNA聚合酶催化新链DNA的合成。 这些过程都是通过控制温度来实现的，即通过改变温度引起变性（denature）、退火（annealing）和延伸（extension），使DNA得以复制。 1、变性 通过加热至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，作为反应的模板。 2、退火 将温度降至引物的Tm值左右或以下（比Tm低5℃，通常为55～65℃），引物与DNA模板互补结合，形成杂交链。 3、延伸 在DNA聚合酶（一种耐热的DNA聚合酶）的作用下，于70～74℃以引物3′端为起始点按5′→3′方向使DNA新链延伸。 上述三步为一个循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此经过25－30个循环，可使新生的DNA片段得以扩增106－9倍（至少扩增105 倍）。 PCR的反应原理也就是PCR的基本过程。 二、PCR反应条件的优化 1、PCR的模板 欲扩增的核酸片段是PCR的模板。 可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。 核酸模板的取材主要依据PCR的扩增对象。 常见的病原体标本有病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等。 病理生理标本有细胞、血液、绒毛、羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养细胞系。 法医学标本有血斑、精斑、毛发等。 还可以从考古样品制备核酸模板。 2、引物 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。 PCR引物的设计与PCR反应的成败关系密切。 引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸。 PCR反应中的引物有两条，即5′端引物和3′端引物，分别与相应的模板链互补。 引物设计遵循下列原则： ①引物长度一般为15～30个碱基。引物过短，扩增的特异性降低；引物过长，虽提高扩增的特异性，但敏感性下降。当长度为19个bp时（419＝2.75×1011 ） ②引物中碱基的发布是随机的尽量避免多聚嘌呤或多聚嘧啶。 ③G＋C的含量在引物的碱基中一般为45％～55％。 ④引物内避免存在互补序列，以免折叠形成发夹结构。 ⑤两引物间不应存在有互补序列，尤其是避免3′端的互补。 ⑥引物的碱基序列不应与非扩增序列有同源性。 ⑦引物的3′端碱基一定要与模板互补配对；而5′则可相对不严，甚至还可做一些修饰，如附加限制性内切酶的位点，引入突变位点等。 3、耐热的DNA聚合酶 在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。TaqDNA聚合酶是目前PCR中应用最广泛的耐热DNA聚合酶。 TaqDNA聚合酶的功能是：以DNA为模板，以四种dNTP为原料，以引物3′端为出发点，按5′→3′的方向，以碱基配对方式合成新的DNA链。 TaqDNA聚合酶有良好的热稳定性，在92.5℃、95℃、97.5℃的高温下，该酶的生物半衰期分别是130min、40min和5～6min。 在PCR操作过程中，变性温度通常是94℃，时间为30～60s，按30轮循环计算，热变性累计时间为15～30min，所以TaqDNA聚合酶能保证PCR循环的需要，无需在每轮循环反应中添加聚合酶，而大大简化了操作步骤。 TaqDNA聚合酶在70～75℃时具有最高的生物学活性。 4、PCR反应条件 1)变性温度和时间 确保模板 DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。 典型的变性温度是95℃，30秒或97℃，15秒。考虑到反应管的传温过程，实际应用中一般应用94℃或95℃变性30－60 秒，并可用热起动。 热起