病毒学- 病毒的检验PPT.ppt

第四节 病毒的检验;常用的病毒检验方法包括：;一、病毒的分离鉴定;病毒的分离与鉴定包括： 1、病毒材料的采集与准备 →2、病毒的分离与培养→3、病毒的形态学观察→4、病毒的理化特性测定→5、病毒的血清学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本过程。 ;（一）标本的采取与送检;应注意下列原则：;（二）病毒的分离与培养;1、病毒的分离;（1）动物接种法;常见病毒常用实验动物及接种途径;在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特异性抗体。 实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。 致死性采血是指尽量采集动物血,直至动物死亡。 非致死性采血是指采集一定量的动物血而不致动物死亡。 对采血动物,应在禁食24h后采血。采血应无菌操作。 不同动物采用不同的采血方法。常用的有心脏采血法、眼眶采血法、颈静脉采血法、颈动脉采血法、耳静脉采血法等。根据实验动物和实验条件灵活选用。;鸡胚对多种病毒敏感。 不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大,因此选择适当的接种途径是病毒分离成功的关键。 一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：尿囊腔、绒毛尿囊膜、卵黄囊和羊膜腔等。;是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。 ;;常见人类病毒的敏感细胞;（4）分子生物学技术;（三）病毒的鉴定;1、初步鉴定;(2)病毒的生物学特性;②血吸附和血凝作用;新城疫病毒能吸附和凝集豚鼠红细胞 风疹病毒能吸附和凝集鸽子、绵羊等红细胞 病毒的血凝作用往往需要一定的pH和温度,利用血吸附和血凝集现象可以为初步判定属于何种病毒提供重要思路。;③干扰现象;（3）病毒的理化特性测定;①代谢抑制法鉴定病毒核酸类型;可直接用纯化的病毒核酸通过电镜观察，对其进行鉴定。但技术要求较高。 近年来,PCR核酸测序技术的应用使得病毒核酸型鉴定的可行性大为增加。 （观看PCR视频）;②脂溶性试验;;处理方法:;③耐酸性试验;处理方法:;2、接种动物的观察;观察指标:;3、最终鉴定;（1）病毒的血清学鉴定;①中和试验;结果判定的科学依据：;操作步骤：;病毒　毒价单位：;病毒毒价的测定（微量法）;;中和试验可应用于： ;②血凝抑制试验;用简式表示:;③免疫荧光试验;免疫荧光试验分直接法和间接法两种:;间接法:将荧光素标记在抗人或抗动物抗体即抗抗体分子上,用来检测抗体与病毒抗原形成的复合物,因此间接法有两对抗原抗体系统。 间接法的优点是敏感性高，标记一种抗体可用于多种抗原的检测; 缺点是有时出现非特异性荧光,所以对操作要求更高。;操作步骤：;（2）病毒的分子生物学鉴定;（3）电子显微镜技术;;二、病毒感染单位的测定;1.空斑试验;;2.终点稀释法;3.荧光-斑点试验;4.转化试验;三、病毒颗粒的检测;免疫电镜(IEM);2、血凝试验;;3、病毒酶活性测定;4、绿色荧光蛋白标记;四、病毒的血清学诊断;血清学技术;（一）病毒抗原的直接检出;1.免疫荧光法(immunofluorescent assay，IF);;2.酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA);3.免疫沉淀(immunoprecipitation);;4.免疫转印(immunoblotting);（二）病毒抗体的直接检出;;;1.中和试验(neutralizing test,NT test);;;2.补体结合试验 (complement fixation test,CF test);;;3.血凝抑制试验(hemagglutinatia inhibition test, HI test) ; 病毒 +鸡RBC = 凝集（血凝试验） 病毒 +特异性抗体 +鸡RBC=不凝集 （血凝抑制试验） 本试验简易、经济，特异性高，常用于粘病毒、流感病毒及乙型脑炎病毒感染的辅助诊断及流行病学调查，也可鉴定病毒的型与亚型。;五、病毒核酸的检测;;1、核酸杂交技术;;2、PCR技术;;3、高通量的病毒核酸检测技术;DNA芯片技术的优点;六、病毒感染的快速诊断;(一) 形态学检查;1、普通光学显微镜检查法;;例如;2、电镜(electron microscopy, EM)检查法;;3、免疫电镜技术术(immune electron microscopy, IEM);;(二)病毒蛋白抗原检查 ;(三)特异性IgM抗体的检测 ;(四) 检测病毒核酸 ;基因芯片;THE END