融合蛋白Rv3872CFP10ESAT6的制备及在牛结核诊断中的初步应用.pdfVIP

!曼塑些堡垒竺竺墨全笙兰苎—叠虿圈 ：垄至Z： 融合蛋I兰I 诊断中的初步应用 刘冬光培，廖娟红坫，于清龙i,2．陈颖钰l，2，陈焕春，郭爱珍1,2 牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法。克隆牛分枝杆菌RDl区上述三个基因，通过酶切连接方法，将三个 0．4mmol L-1诱导3h，目的蛋 基因串联在pET-28a载体上。基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG 在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下。敏感性获得了显著提高，这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立 具有重要意义。 关键词：牛结核：Rv3872：CFP-IO：ESAT一6：诊断 牛结核病是一种严重危害奶牛业的人兽共患传染病． 的蛋白被用作鉴别诊断抗原．研究较多的蛋白为培养 FiltrateProtein10．CFP一10)和早 由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis。M．boris)感染所致。滤液蛋白一lO(Cuhure 由于目前为止尚无有效手段防治牛结核病。因此．我国 6。 期分泌性抗原蛋白6(EadySecretoryAntigenicTarget 及国际上其他国家普遍采用“检疫一扑杀”政策控制牛 结核。发达国家牛结核控制相对较成功，但在发展国家。 因编码的两个低分子量分泌蛋白．从结核分枝杆菌短 该病对牛和人的健康正构成严重威胁。因此，准确、简便、 快速的诊断方法对于该病的防治显得尤为重要【埘。 目前牛结核法定检疫方法是结核菌素皮内变态 反应，即以皮内注射一定量的牛结核菌素。测量72dx时运系统中的关键因子．敲除Rv3872会中止复合体的合 后比较注射部位皮厚增加程度．增加4ram以上判断了成与分泌．可能参与了复合体的合成和分泌过程嘲。对结 阳性。该方法灵敏度高。但具有如下缺陷：由于结核菌 核病人的研究表明．Rv3872作为血清学诊断抗原可能 素含有与卡介苗与环境分枝杆菌相同的非特异性抗原 较前两种蛋白具有更大的潜力．但Rv3872是否能在牛分 组分．检测时容易出现假阳性；结核菌素皮内变态反应 枝杆菌感染牛体内诱导抗体产生未见报道。为此，本研究 对感染后期的开放性结核及全身性结核不敏感：变态 反应程序繁琐、耗时费力、结果判断主观性强．需专业 表达载体．表达纯化了该融合蛋白，初步试验表明三蛋 人员操作：只能进行活体试验，而不能保存样品和进行 白融合显著增加了牛结核检测灵敏度．为下一步建立更 回顾性分析，更不适用于野生动物牛结核病检查。因此． 加灵敏快速的牛结核检测方法奠定了基础。 牛结核抗体快速诊断和检测方法相继在国内外建立． 1材料和方法 包括ELISA和试纸条。抗体检测方法虽然特异性高．但1．1材料 灵敏度低。为了提高检测灵敏度。不同抗原蛋白的融合 1．1．1质粒、菌种和血清 蛋白被用作诊断抗原【l-弼。 与毒力型结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(Mycobac— terium bovis)基因组相比，所有卡介苗(Mycobaeterium bovis BCG．BCG)和田鼠分枝杆菌(Mycobaeterium 李传友研究员惠赠。所检测44份牛血清(26份牛结核阳 mieroti)基因组中均缺失RDl区M．所以RDl区基因编码 ：2量墨：I叠蛋回囝 !璺堑些垫全!竺兰全笙兰竺 性和18份牛结核阴性)为本实验室保存。阳性血清经牛