脂肪来源干细胞在软组织填充中的应用研究.docVIP

精品论文 参考文献 脂肪来源干细胞在软组织填充中的应用研究 暴志国 张建文 王琪影 张歌（解放军第153医院整形激光美容外科 河南郑州 450000） 　　【摘要】目的 探讨脂肪来源干细胞在辅助软组织填充中的应用及研究。方法 1.利用消化法提取脂肪来源干细胞（ADSCs）收集第3代细胞作为种子细胞。2.实验共分3组:组①ADSCs按50times;106个/ml浓度与透明质酸钠凝胶(HA)1:1混合;组②单纯ADSCs配制成浓度25times;106个/ml浓度;组③单纯透明质酸钠凝胶。每一样本0.2ml注射到裸鼠(12只,6w雄性)背部皮下 ,每组各1个点,3个月后分别取材。将获得标本,分别从大体外观、体积、质量、组织学等方面进行分析。结果 组①、组②可见有新生组织形成，组③未见新生软组织形成，Masson三色染色法组①、组②中均可见少量脂肪细胞及胶原蛋白形成。RT-PCR示组①、组②中均见到人类mRNA表达。Western blot示组①、组②中均可见I型胶原蛋白表达。结论 ADSCs+HA可以构建出新生软组织，ADSCs有促进局部胶原蛋白形成的作用。 　　【关键词】脂肪来源干细胞 组织工程技术 透明质酸钠凝胶 胶原蛋白含量 　　【中图分类号】R62 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）46-0028-02 　　如今，一种理想、安全、有效的注射材料的研究也成了整形美容外科一个新的课题。透明质酸（HA）是一种天然的高分子多糖,是一种细胞基质成份，具有非抗原性，不会引起炎症和异物反应,无致敏性、容易获得优点使透明质酸凝胶成为目前应用最为广泛软组织填充剂[1]。应用组织工程技术,选择HA为支架材料，以ADSCs为种子细胞构建种子细胞+支架复合物成了一个新的研究方向。实验将复合材料移植于免疫缺陷的裸鼠体内，观察植入物与宿主之间的相互影响及种子细胞+支架复合物在宿主体内的最终转归，寻找一种更安全、有效、微创的软组织填充方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂 II型胶原酶、DMEM培养液、胎牛血清、PBS液、胰蛋白酶、碱性成纤维细胞生长因子、透明质酸钠凝胶。 　　1.2 主要器材 　　超生组织匀浆机、纯水系统、恒温CO2培养箱、低温台式离心机、精密天平、恒温摇床、倒置相差显微镜、超净工作台、培养瓶、离心管、脂肪抽吸针等。 　　1.3 实验动物 BALB/c Nude 裸鼠，12只5w龄，雄性。 　　1.4 细胞培养 　　利用消化方法提取ADSCs，DMEM完全培养基培养，取第3代细胞作为实验种子细胞。将ADSCs配置成50times;106个/ml浓度备用。 　　1.5 干细胞表面标志物鉴定 　　本次试验ADSCs第3代细胞，测定具有干细胞特性的表面标志物CD44、CD49、CD105等，证明具有干细胞特性即可。 　　1.6 ADSCs移植 　　实验共分3组:组①ADSCs按50times;106个/ml浓度与HA以1：1混合;组②单纯ADSCs，浓度为25times;106个/ml;组③单纯透明质酸钠凝胶。按每一样本0.2ml注射到裸鼠(12只,6w雄性)背部皮下,每只裸鼠背部形成3个点,每组各1个点。 3个月后取标本,进行检测分析。 　　1.7 体积、质量测量 　　以1ml精密注射器，测量标本体积。精密天平，测量标本质量。 　　1.8 Masson三色染色法 　　Masson三色染色法印染标本组织，明确组织成分。读片：胶原蛋白呈蓝色，脂肪呈空泡状，细胞核呈红色。 　　1.9 通过RT-PCR测定新生组织染色体ZFXmRAN收集标本组织，超生粉碎使之形成悬浊液，加入细胞裂解液，提取组织RNA、纯化、逆转录，PCR机扩增，琼脂糖电泳凝胶电泳，采用Gel Doc 2000凝胶图像分析仪采集图片，基因编码区的引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。 　　1.10 统计分析 　　将数据导入SPSS 17.0统计包。应用卡方单因素检验，及LDS行组间差异分析。 　　2 结果 　　2.1 ADSCs的培养及鉴定 　　人ADSCs在完全培养基DMEM生长状态良好，成单层细胞生长，24小时内贴壁，刚贴壁细胞成菱形，多边形或三角形，随着生长逐渐形成梭形，纺锤状，细胞排列紧密，呈集落状生长。利用流式细胞仪分选技术，可见ADSCs表面标记物CD44、CD49、CD105均为阳性，说明细胞具有干细胞特性。 　　2.2 细胞支架复合物构建结果 　　复合物植入裸鼠背部皮下可见黄豆大小肿块，组中裸鼠生命体征平稳，状态良好，注射局部均无炎症反应。第一周：组①ADSCs+HA组，体积无明显缩小