脂多糖对胆管癌细胞株活性及凋亡的影响.docVIP

精品论文 参考文献 脂多糖对胆管癌细胞株活性及凋亡的影响 1.湘潭市第一人民医院普外3科 411101；2.赣南医学院附属医院普外2科 341000 【摘 要】目的：检测CXCR4抑制剂LPS对胆管癌细胞株QBC939生长和凋亡的影响，探讨LPS作为胆管癌靶向治疗的可行性。方法：免疫细胞化学SP法检测胆管癌细胞株QBC939中CXCR4的表达；观察LPS对QBC939细胞的生长的抑制作用；流式细胞仪检测LPS对QBC939细胞凋亡的影响。结果：QBC939细胞株中CXCR4蛋白呈阳性表达。LPS对QBC939细胞生长有抑制作用，LPS浓度越高，对QBC939细胞生长的抑制越明显。各浓度LPS可不同程度地诱导QBC939细胞凋亡，5.0ug/ml浓度LPS对凋亡的诱导最明显（Plt;0.05）。结论：胆管癌细胞株QBC939中CXCR4蛋白呈阳性表达；CXCR4抑制剂LPS 能抑制胆管癌细胞株QBC939的生长，并能明显诱导细胞的凋亡。 【关键词】胆管癌细胞；CXCR4；脂多糖；凋亡 CXCL12（即基质细胞衍生因子1 stromal cell derived factor-1，SDF-1）是一种趋化因子，由基质细胞分泌，CXCR4是CXCL12的唯一受体。CXCR4基因在肿瘤的生长与转移过程中发挥重要的作用，通过抑制其表达，可望达到抑制或延缓肿瘤的生长与转移。胆管癌组织中CXCR4蛋白高表达，而且与转移及预后相关[1]。本实验在免疫细胞化学法证实人胆管癌细胞株QBC939中CXCR4蛋白阳性表达的基础上，采用胆管癌细胞与CXCR4抑制剂LPS共培养后，观察LPS对QBC939细胞生长和凋亡的影响，旨在为胆管癌的基因治疗提供实验依据。 1材料与方法 1.1 材料 人永生化胆管癌细胞系QBC939，由第三军医大学西南医院肝胆外科中心王曙光等建株，购自湘雅医院实验室。主要试剂：溴化二甲基噻唑二苯四氮唑（MTT）：美国AMRESLO公司。鼠抗人CXCR4单抗（购自Ramp;D公司，clone：44716），辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（二抗）Santa Cruz 公司（USA）。流式细胞仪：Becton Dickinson公司，FACStarplus型，美国。 1.2 实验方法 1.2.1细胞培养与分组 人胆管癌细胞株QBC939，用含10％ 小牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃，5％浓度的CO2培养箱中培养，0.25％的胰蛋白酶消化传代，收集70％～80％融合、处于对数生长的细胞传代接种于6 孔板内，调整细胞浓度，使每孔的细胞数为 3 times;105 /ml，分别加入LPS，使LPS浓度分别为0.1ug/ml、1.0ug/ml和5.0ug/ml，每组设5个复孔，为试验组，分别标为LPS1、LPS2、LPS3。对照组不加LPS，加等量培养液，培养24小时后进行后续实验。 1.2.2 免疫细胞化学检测QBC939中CXCR4蛋白的表达 取对数生长的QBC939细胞用0.25％胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1times;105/ml，接种于六孔培养板（内放有盖玻璃片）内爬片，于37℃、5％CO2浓度的培养箱中培养，24小时后用4℃、3.7％多聚甲醛固定10分钟；将已经固定的细胞用4℃PBS漂洗3次，用0.1％Triton X－100处理20分钟以增加细胞通透性，PBS清洗2times;5分钟；1％H2O2处理3分钟阻断内源性过氧化物酶，PBS清洗3times;5分钟；滴加正常羊血清，于37℃湿盒中孵育30分钟以消除非特意性着色；吸干正常羊血清，滴加特异性的CXCR4蛋白抗体，于37℃湿盒中孵育30分钟，4℃冰箱过夜；PBS清洗3times;5分钟，滴加生物素标记的二抗，于37℃湿盒中孵育45分钟；PBS清洗3times;5分钟，滴加试剂SP，37℃湿盒中孵育30分钟；PBS清洗3times;5分钟，双蒸水清洗5分钟滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色，自来水中止显色，苏木素复染细胞核，取出玻片，吸水纸吸干，甘油封片。阴性对照用PBS代替一抗。试验阳性为细胞膜或细胞质内出现棕黄色着色颗粒。 1.2.3 光镜观察LPS对QBC939细胞的生长抑制 将各组细胞用含10%新生牛血清的1640重悬，倒置显微镜下计数细胞，调整细胞浓度为1times;104/ml；将各组细胞接种于96孔板内，每组0.2ml，每组设置5个复孔；常规条件下培养24小时后，光镜下观察各组细胞的生长情况。 1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡