第二讲酵母双杂交系统.pptVIP

预防兽医学进展 第二讲 酵母双杂交系统 酵母的基本特征 酵母双杂交的原理 酵母双杂交的应用 酵母菌 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比细菌大几十倍甚至十几倍 大多数以出芽方式进行无性繁殖，也有的呈分裂繁殖 有性繁殖是通过接合产生子囊孢子 酵母菌子囊孢子的观察 子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。 在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。 酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种属的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。 Sexual spores Ascospore Formed in a sac (ascus) 酵母双杂交的原理 Fields 与Song于1989年首先创立 典型的真核生长转录因子（如GAL4） ， 都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。 基因调节示意图 LexA酵母双杂交实验的基本流程 1.??将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选2.??同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞3.??构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait) 酵母双杂交实验的基本流程 4.??将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性 4-1.??如果pLexA-X 能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少半乳糖苷酶的信号作用 4-2.??如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母 酵母双杂交实验的基本流程 5.??如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。 5-1.??用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数5-2.??上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但半乳糖苷酶无表达。5-3.??同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。5-4.??将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。 酵母双杂交实验的基本流程 6.??阳性克隆的筛选6-1.??随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coli KC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒6-2.??如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆 酵母双杂交实验的基本流程 7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆7-1.??将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10％-20％左右的频率随机丢失7-2.??将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，30?C孵育2-3天7-3.??再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子7-4.??将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆 酵母双杂交实验的基本流程 8.??酵母杂合试验(Yeast M