120KDa纤维粘连蛋白片段诱导腰椎间盘退变的试验研究.docVIP

精品论文 参考文献 120KDa纤维粘连蛋白片段诱导腰椎间盘退变的试验研究 郭元利 胡宝山（通讯作者） 芮钢 尤元璋（厦门大学附属第一医院骨科 福建厦门 361012） 【中图分类号】R681.5+3 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）47-0040-02 【摘要】 目的 观察120KDa Fn-f能否诱导兔椎间盘发生退变。方法 将30只新西兰大白兔，分为2、4、8、12、16周共5组。以微量注射器于L4/5、6/7注入1mu;mol/L的120KDa Fn片段25mu;L作为试验组，于L5/6注入25mu;L无菌PBS液作为对照。于相应时间点行影像学、组织病理学、电镜和RT-PCR方法检测椎间盘的相应变化。结果 试验组MRI T2成像可见第8周始髓核开始脱水，16周几乎完全消失，所有对照组均未有同样变化。X片显示12周椎间盘前方骨赘形成。组织学和电镜检测发现从第4周开始纤维环结构、髓核基质均开始发生渐进性退变的变化。RT-PCR检测Aggrecan的基因表达发现从第8周始开始出现逐渐下降趋势。结论 120KDa Fn-f能够诱导兔椎间盘发生退变，发生机制需进一步的研究。 【关键词】椎间盘退变 纤维粘连蛋白 基因表达 生物大分子 1 材料与方法 1.1 实验材料 3～4月龄的新西兰大白兔30只，体质量2.6kg，雌雄不限。由中山大学附属第二医院实验动物部提供[许可证号scxk(粤)2003-0001]。主要试剂：120KDa Fn（美国Chemicon公司），TRIzol 试剂（美国 MRC公司），M-MLV 逆转录酶（美国Promega公司），5times;M-MLV Buffer、RNA酶抑制剂、100bp DNA Marker、5mM dNTP Mixture、TaqTMDNA聚合酶（TaKaRa中国大连公司）。主要仪器：OLYMPUS CX-40 显微镜（日本Olympus光学工业株式公司），Gyroscan intera T 1.5磁共振仪（德国Philip公司），高速离心机（德国Philip公司）。 1.2 注射方法 将30只新西兰大白兔，分为2、4、8、12、16周共5组。采用氯氨酮35～50mg/kg、安定3～5 mg/kg联合肌肉注射麻醉后，取右侧卧位，经腹外侧入路显露椎体和椎间盘。用本试验小组手术方法以微量注射器于L4/5、6/7注入1mu;mol/L的120 KDa Fn片段25mu;L，于L5/6注入25mu;L无菌PBS液作为对照。术后回归笼内饲养，自由活动，于相应时间点做相应检测。 1.3 MRI和CR检测 分别于第2、4、8、12??16周取6只动物麻醉后行X线片、MRI检查。X线片为CR摄片，由本院放射线科完成。MRI采用SE序列，行失状位扫描，重复时间2500msec，回波时间90msec，取T2加权像。同时行轴线位经由椎间盘中份的扫描，排除脊柱的先天畸形和椎间盘退变。 1.4 HE、Masson三色、高碘酸-Schiff染色组织学观察 术后第2、4、8、12、16周组各取2只进行检查。注入5～10 mL空气致死。取出L3/4、L4/5、L5/6、L6/7椎间盘（包括上、下终板）。用4％多聚甲醛溶液固定48～72h，用0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA) (pH=7.4)脱钙2周，针刺法检测脱钙程度。再次修整标本，行梯度酒精脱水、二甲苯固定、石蜡包埋，椎间盘水平面切片，厚5mu;m。做HE、Masson三色、高碘酸-Schiff染色。光学显微镜下观察并照像。 1.5 电子显微镜观察 同法处死实验动物，分别取有代表性的髓核、纤维环标本，体积分数5％戊二醛、4％多聚甲醛混合固定液固定样品，脱水、包埋及切片后行扫描电镜观察椎间盘内基质的变化情况。 1.6 分子生物学检测 半定量RT-PCR评价Aggrecan mRNA的变化，术后第2、4、8、12、16周组各取3只进行检查，同法处死实验动物，分别取出L4/5、L5/6、L6/7，去除上下终板，称重。取等重椎间盘组织提取总RNA，逆转录后PCR法扩增Aggrecan目的片段，以GAPDH作为内参，引物和反应条件为：Aggrecan引物5-CGA GAA TCA AAT GGA GCC G-3，5-CAC AAC ACC TTT CAC CAC GAC-3 理论片段长度175bp，GAPDH引物5-CCA TGT TGT GAT GGG CG-3，5-TCA ACA GTG CCA CCC AC