性腺分化前龟的Dmrt1基因的温度依赖性表达.docVIP

性腺分化前龟的Dmrt1基因的温度依赖性表达 Jae R. Kettlewell1，Christopher S. Raymond1，和David Zarkower1,2* 1生物化学、分子生物学和生物物理学研究生课程明尼苏达大学明尼阿波里斯市明尼苏达州 细胞生物学和发展明尼苏达大学明尼阿波里斯市明尼苏达州 脊椎动物采取染色体遗传和非染色体遗传两种方法来决定其胚胎性别的改变。在爬行动物中，温度依赖性性别决定比较普遍。在性别分化前的关键时期，孵化温度可能通过改变温度控制决定因子的活力及表达，从而决定了其胚胎的性别。Dmrt1基因家族是一个与性别决定相关的发育基因家族Dmrt1 mRNA 在生殖嵴中的量较在促雌性温度下时多。Dmrt1是首个发现在性别决定期间具温度依赖性表达的基因，可能在爬行动物性分化进化中起到了重要作用。 关键词：性别决定；Dmrt1；温度依赖性；睾丸；多耳彩龟；爬行动物；TSD 温度依赖性性别决定广泛存在于爬行动物类群中，但在分子水平上的依据还不清楚。在胚胎发生阶段，性别决定的关键时期（Yntema1979)，对应不同的温度至少有一种性别决定途径表现为不同活性。爬行动物性别决定具有很高的热敏性：在一些物种中，小于2℃的温度差异就足以实现性别从雌性向雄性的转变，反之亦然（Ferguson 和Joanen，1982）。爬行动物里未发现Sry基因的同系物，但哺乳类的其他几个性别决定因子已经鉴定出来（Spotila et al.，1998；Western et al.，1999；Wibbels et al.1998）。在同系物的测定中，有报道称Sox9的表达具有温度敏感性（Moreno-Mendoza et al.，1999；Spotila et al.，1998； Western et al.，1999Sox9 mRNA的表达量在雄性性腺开始升高，在这一阶段内，睾丸和卵巢会在形态学上产生明显的区别（Western et al.，1999）。所以在Sox9发挥作用之前，至少存在一种和性别决定有关的温度依赖性介质。 Dmrt1基因在脊椎动物的性别进化，是一个相当古老的基因。在果蝇和线虫中（Erdman和 Burtis，1993) and mab-3 （Raymond et al.，1998DNA序列相结合。在人类中，DMRT1地图中有一长9p24.3的染色体区间，Raymond et al.，1999bRaymond et al.，1999aRaymond et al.，1999aDmrt1 mRNA对温度依赖性。 我们对基于序列高度保守的简并的人和老鼠或人和鸟之间的Dmrt1蛋白的寡核苷酸进行处理，通过RT-PCR阶段15和阶段17的生殖嵴/中肾的RNA分离对应于T. scripta Dmrt1的cDNA片段。被这些引物所扩展的cDNA片段包含从DM域中部扩展到蛋白羧基末端Dmrt1序列以及3/4的基于人和老鼠的Dmrt1蛋白大小的预测的Dmrt1编码序列Dmrt1序列的比对（图1），发现T. scripta蛋白与其他物种的Dmrt1很相似，尤其是短吻鳄（在两者的克隆里有94%相同）和鸡（有78%相同）。 变温实验表明，T. scripta和其他龟类的性别分化的热敏期大概是15天到19或20天（Bull and Vogt， 1981； Pieau Dorizzi，1981； Wibbels et al.，1991Dmrt1 mRNA的表达进行检测。在早期的老鼠的生殖嵴和鸡的胚胎中Dmrt1 mRNA有所表达（Raymond et al.，1999aT. scripta的胚胎的生殖嵴中发现了相似的表达（图2），在整个T. scripta的原位杂交过程中，26℃（促雄性发育）和32℃（促雌性发育）温度孵化下的胚胎发育中的生殖嵴和中肾复合物的探针表明Dmrt1 mRNA的表达发生在生殖嵴中。在26℃下时，其第17天（图2a）和第20天（图2b）在胚胎生殖嵴中的表达量较高。在26℃下孵化的胚胎中尤其是在第17天也可检测到一些表达量。所以，在性别分化的热敏期内Dmrt1 mRNA的表达量在促雄性发育的温度下较高。因为检测到Dmrt1较低水平的表达我们无法确定在生殖嵴中该细胞表达Dmrt1。 我们对生殖嵴/中肾复合物的RNA进行RT-PCR，以对具温度依赖性的Dmrt1 mRNA进行定量检测（图3）。在现有条件下，少于两倍的cDNA浓度差异可以检测出来（数据未显示）。在胚胎孵化的第15天、17天和第20天，Dmrt1 mRNA的表达量在促雄性发育的温度下更高。与前人的结果相一致（Moreno-Mendoza et al.，1999；Spotila et al.，1998Sox9引物进行RT-PCR未检测到或检测到少量与温度依赖性有关