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转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测 实验目的 掌握基因GUS的表达的检测方法 了解GUS基因的应用 实验原理 GUS基因就是转β-葡糖醛酸酶基因 ，它存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其分解产物呈蓝色。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。根据地gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高），其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS基因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。 实验材料、试剂 拟南芥AK12-pro、GUS工作液 实验步骤 1、取2支1.5ml离心管，各加入0.3ml 1mol/L GUS染色液； 2、用镊子夹取 转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心管中； 3、37℃浸泡过夜。 4、倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色；肉眼下观察染色情况；拍照。如果有GUS基因表达产物，则出现蓝色。 实验结果 从上述照片中科一看出，将野生型和转基因型拟南芥用含有底物的缓冲液浸泡，转β-葡糖醛酸酶基因将X-Gluc水解生成蓝色产物，说明组织细胞被转入了GUS基因，并表达出GUS，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性，图中拉瑟比较深，说明Gus活性相对较高。 分析与讨论 通过野生型和转基因型的对照，明显的看出，转基因拟南芥中报告基因GUS明显的检测出来，其颜色的深浅反映了Gus基因的活性。 组织化学定位法的优点 组织化学定位法是使底物进入被测的植物组织、细胞或原生质体中,通过显色反应可直接或在光学显微镜下观察组织器官甚至单个细胞内GUS 的活性,而不必从组织中提取酶[1]。GUS 作为报道基因的主要优点之二是其产物有多种分析方法。用不同的β2葡萄糖苷类物质作底物,发展了不同的分析方法,如组织化学定位法、分光光度法、荧光法、聚丙烯酰胺凝胶原位分析法等。目前常用于GUS 组织化学定位的酶作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷酸(52bromo242chloro2 32indolyl glucuronide ,简称X2Gluc) 。这一底物能够在酶活性位点形成蓝色沉淀物。β2葡萄糖苷酸酶作用于X2Gluc 的初始产物为无色的吲哚衍生物,经过氧化二聚化作用形成不溶解的5 ,5′2 二溴-4 ,4′-二氯深色的靛蓝色物质,使得具有GUS 活性的部位呈现蓝色。这一二聚化作用能够在大气中的氧气作用下形成,植物体内的过氧化物酶也能够促进氧化二聚化作用。 3、实验中存在的问题 ①植物体内局部的过氧化物酶可能加强葡萄糖苷酸酶的局部表现,有时在GUS 表达水平很高的组织中会发生无色反应中间产物渗漏的现象,因此染色程度不能准确地反映出GUS活性。通过在底物溶液中加入铁氰化钾/ 亚铁氰化钾的混合物作为氧化催化剂加强二聚化作用可以解决这一问题[2]。②由于植物细胞具有细胞壁,为使底物更好进入细胞,可采用抽真空几分钟的办法。如果不抽真空,在植物叶片上蓝色沉淀就会少一些,有时候甚至检测不出来。③个别植物如黑麦叶片发育初期及一些植物的雄配子体、果实和种子里有内源GUS 或内源类GUS活性[3～5 ] ,因此检测时要设置严格的阴性及阳性对照。 参考文献 [1] 王艳丽, 叶兴国, 董芳, 等. 高羊茅和黑麦草农杆菌介导转化体系的研究[J]. 中国生物工程杂志, 2007, 27(1): 22-27. [2] 黄晓璪, 陈青, 薛朝阳, 等. 番茄花叶病毒移动蛋白基因转化烟草及在转基因烟草中的表达[J]. 南京农业大学学报, 2001(4): 5-8. [3 ] 　Schulz M et al . Phytochem , 1987 , 26 (4) : 933 —937 [4 ] 　Plegt L et al . Mol Gen Genet ,1989 , 216 : 321 —327 [5 ] 　Hu CY et al . Plant Cell Rep , 1990 , 9 : 1 —5 野生型 转基因型