公猪繁殖力相关基因ADAD1地克隆与分析.doc

公猪繁殖力相关基因ADAD1的克隆与分析 1、相关定义 1.1、植物病程相关蛋白的定义及分类 Van Loon 等人在 1970 年首次在烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)侵染 的烟草叶片中检测到与过敏性反应(hypersensitive reaction, HR)相关的蛋白,当时 称之为 b 蛋白,10 年后将其命名为病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, PRP/PRs)。PRP 是指植物在病理或病理相关的环境下诱导产生的一类蛋白。1989 年 在西班牙召开的植物病程相关蛋白研讨会提出”病理或病理相关的环境”是指胁迫环 境或逆境,如某些病原物(真菌、细菌、病毒和类病毒)的侵染、某些化学制剂应用 等。在植物自然衰老期间合成的相关酶也都属于病程相关蛋白[12]。PRP 不仅在被侵 2 染组织中诱导表达,而且在未侵染组织中也有表达,与系统获得性抗性有关,是植物 产生 SAR 的一个显著标志[13]。 PRP 最初根据蛋白质寄主来源和在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率为标准分类, 随着对 PRP 基因组的分离、克隆、表达的研究不断深入,形成了按氨基酸序列同源 性、血清学关系、电泳迁移率(分子量)和植物来源为标准的分类体系[14-16],已发现 的 PRP 被分为 17 个家族,即 PR1 到 PR17[17-19],PRP 的类型及特性见表 1。 表 1 植物病程相关蛋白家族[12] Table 1 The family of plant pathogenesis-related proteins 类型 类型代表蛋白 特征 基因特性 Family Type number Properties Gene symbols PR-1 烟草 PR-1a 抗真菌活性 Ypr1 PR-2 烟草 PR-2 β-1,3-葡聚糖酶 Ypr2 PR-3 烟草 P, Q 几丁质酶 class,Ⅱ,Ⅳ,Ⅴ Ypr3,Chia PR-4 烟草 R 几丁质连接蛋白 class,Ⅱ Ypr4,Chid PR-5 烟草 S 类甜味蛋白 Ypr5 PR-6 马铃薯 Inhibitor Ι 蛋白酶抑制剂 Ypr6,Pis(Pin) PR-7 马铃薯 P69 内源蛋白酶 Ypr7 PR-8 黄瓜几丁质酶 几丁质酶 class Ypr8,Chib PR-9 烟草木质素形成过氧化物酶 过氧化物酶 Ypr9,Prx PR-10 欧芹 PR1 类核糖核酸酶 Ypr10 PR-11 烟草 class V 几丁质酶 几丁质酶,class Ypr11,Chic PR-12 萝卜 RsAFP3 防卫素 Ypr12 PR-13 拟南芥 THI2.1 硫堇 Ypr13,Thi PR-14 大麦 LTP4 脂质转移蛋白 Ypr14,Ltp PR-15 大麦 OxOa(胚) 草酸氧化酶 Ypr15 PR-16 大麦 OxOLP 类草酸氧化酶 Ypr16 PR-17 烟草 PRp27 未知 Ypr17 1.2、EST的概念和技术原理 EST是指从cDNA文库中随机挑取克隆,对其进行一轮大规模测序所获得的部分 cDNA的5或3端序列,长度一般为1 00一5()obp。EST作为基因的”窗口”,可以代表生 物体某种组织某一时间的一个表达基因,所以被称为”表达序列标签,,。截至到2007 年5月18日,NCBI的EST数据库中已经收录43,259,126条EST,其中猪的EST 有646,392条(http:// www.nebi.nlm.nih.g()v/dbEsT/dbEsT一umma以html)EsT的技 术原理:一个典型的真核生物分子由5气UTR(5非翻译区),ORF(开放阅读框架), 3一uTR(3非翻译区)和polyA四部分组成。其cDNA具有对应的结构。对于任何 一个基因,其5忆UTR和3气UTR都是特定的,即每条cDNA的5或者3端的有限序 列即可特异性地代表生物体某种组织某个时期的一个表达基因。来自某一组织的足 够数量的EST即可代表某组织中的基因的表达情况。多数情况下,某组织的总体EST 中的某一种cDNA的测量次数可以代表它在该组织中的表达丰度(于凤池,2005)。 White JA等(2000)将这种以cDNA测序来估计基因表达水平的方法称为”电子 northern,或者”数字northem,,。具体方法是首先从组织细胞中提取总mRNA,构建成 标准cDNA文库,然后从中挑选大量克隆,利用载体通用引物测插入载体的CDNA 片段5或者3端300一500的碱基序列。将测序所得的EST与dbEST等数据库中的数 据进行比较分析,根据核酸或蛋白质序列的同源性比较,可以鉴定出哪些EST代表 己知基因,哪些代表未知基