HLAA-0201-Kb及MAGE3基因共转染B16细胞制备及其在MAGE3.docVIP

HLAA*0201/Kb及MAGE3基因共转染B16细胞制备及其在MAGE3 　【摘要】 目的: 为了用HLAA2.1转基因鼠制备荷瘤模型以评价肿瘤疫苗的免疫效果, 制备共表达HLAA*0201/Kb嵌合基因和MAGE3的B16黑色素瘤细胞。方法: 采用基因共转染的方法, 将HLAA*0201/Kb和MAGE3转染到B16黑色素瘤细胞（B16HLAMAGE3）, 利用RTPCR、 流式细胞术（FCM）和Western blot检测了HLAA*0201/Kb和MAGE3在B16黑色素瘤中的表达; 通过测定CTL活性和体内抑瘤实验证实肿瘤抗原MAGE3可以在B16HLAMAGE3中得到有效加工处理和提呈。结果: RTPCR、 FCM和Western blot检测到HLAA*0201/Kb和MAGE3在B16HLAMAGE3黑色素瘤中的表达; LDH的方法观察到MAGE3疫苗免疫小鼠脾细胞对B16HLAMAGE3细胞的特异性CTL反应, 抑瘤实验也证实, B16HLAMAGE3细胞在免疫小鼠体内生长明显受到抑制。结论: MAGE3基因在B16HLAMAGE3黑色素瘤细胞中得到表达, 并被有效的加工处理、 提呈给特异性CD8+T细胞; B16HLAMAGE3细胞可以用来制备荷瘤模型, 且该方法适合利用转基因小鼠用于人表位疫苗的体内评价。 【关键词】 HLAA2.1转基因鼠 疫苗评价 肿瘤动物模型 基因共转染 MAGE3 pIRES 　　随着对肿瘤主动免疫疗法研究的不断深入, 人们逐渐认识到CTL反应在肿瘤免疫中发挥着重要作用, 肿瘤抗原CTL表位的研究受到广泛关注, 许多重要的肿瘤抗原如黑色素肿瘤基因（MAGE）家族、 α甲胎蛋白（AFP）及erbB2的CTL表位已被鉴定和识别[1-3]。该工作使肿瘤疫苗的研究尤其是肿瘤表位疫苗的研究得到了迅速的发展。另外, 对肿瘤疫苗的有效评价是肿瘤疫苗研究的一个重要方面。目前, 对人用肿瘤疫苗评价的研究应得益于HLA转基因小鼠的使用[4], HLAA2转基因小鼠是评价HLAA2限制的表位疫苗的有利工具。但是, 由于缺少表达HLA/H2Kb及人类肿瘤抗原的动物肿瘤细胞株, 对肿瘤疫苗的评价只能通过诱导CTL反应的手段即通过体外实验来进行。而对一种肿瘤疫苗的评价, 仅凭体外实验的结果是不够的, 如对疫苗抑瘤作用机制、 疫苗对肿瘤微环境的影响等方面的评价, 必须通过体内或宿主水平的实验来进行。因此, 为了补充HLAA2转基因小鼠在肿瘤疫苗评价中的作用, 本实验建立了一种既表达HLA/H2Kb嵌合基因, 又表达人的肿瘤抗原MAGE3的小鼠肿瘤细胞株B16HLAMAGE3, 并对该细胞株的特点及功能进行了鉴定。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 pcDNAMAGE3和pET32aMAGE3重组表达载体由本室构建; 小鼠黑色素瘤B16细胞株由本室保存; RNA提取试剂RNAex regent及DNA纯化试剂盒购自上海华舜公司; 逆转录试剂盒、 PCR反应混合物、 限制性内切酶Nco I、 Xho I, T4连接酶、 DNA及Mr标准品均为TaKaRa公司产品。质粒抽提为Vgene产品; 真核表达载体pIRES及受体菌TOPO10由本教研室保存。异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）为Solarbio产品。细胞转染试剂 （LIPOFECTAMINE）为Introvigen公司产品; 多肽MAGE3（271279） FLWGPRALV由上海波泰生物科技有限公司合成。LDH检测试剂盒购自德国Roche公司; rIL2购自晶美生物技术公司; MAGE3融合蛋白由本室纯化。HLAA*0201转基因鼠（含有HLAA*0201的α1和α2结构域和H2Kb的α3及胞内区结构域）由上海第二军医大学遗传教研室馈赠（许可证号: SCXKHU。所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 HLAA*0201/ Kb嵌合基因和MAGE3的扩增 取HLAA*0201转基因鼠脾脏, 常规抽提总RNA并反转录, 用P1和P2引物扩增HLAA*0201/Kb嵌合基因。P1: 5′CCGCTCGAGATGGCCGTCATGGCGCCCCG3′(引入Xho I酶切位点), P2: 5′CGACGCGTCTGTCTTCACGCTAGAGAATG3′（引入Mlu I酶切位点）; 根据GenBank人MAGE3基因序列（U03735）设计P3和P4引物: P3: 5′ggaattcaagcctcttgagcaga