HIV1病毒Nef基因克隆、 表达、 纯化及其抗体制备.docVIP

HIV1病毒Nef基因克隆、 表达、 纯化及其抗体制备 　【摘要】 目的: 运用基因工程方法制备HIV1 Nef 重组蛋白及其抗体。方法: 用PCR 技术从HIV1 H×B2质粒中扩增HIV1 Nef基因, 将测序鉴定过的HIV1 Nef 基因克隆到原核表达载体pET28a(+)上, 应用酶切鉴定、 测序、 SDSPAGE及Western blot等方法鉴定基因片段的正确性及表达蛋白的特异性。纯化的重组蛋白免疫兔3次后, ELISA法测定兔多克隆抗体滴度。用其制备的多克隆抗体通过免疫组织化学方法测定表达Nef基因的内皮细胞。结果: 成功地构建了Nef基因的原核表达质粒, 测序证明HIV1 Nef基因全长为621 bp, 编码206个氨基酸。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白为包涵体的形式。HIV1 Nef 蛋白N端融合6×His标签便于纯化及鉴定。获得的高纯度HIV1 Nef 融合蛋白, 免疫动物后, 可产生特异的高滴度抗体（ELISA滴度达1∶10000）。将转染Nef基因的内皮细胞,应用免疫组化的方法证明其抗体有高度的特异性。结论: 构建了高表达HIV1 Nef蛋白的原核表达系统, 制备的Nef重组蛋白免疫动物, 获得了特异、 高效价的抗体, 为研究Nef基因的生物学活性提供了实验材料和依据。 【关键词】 HIV1 Nef 基因表达 抗体 病毒 　　人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的早期基因负调控因子（negative regulation factor, Nef）是HIV1 调节蛋白之一。在HIV/AIDS 的致病中可能具有重要作用。临床研究表明, 在HIV感染长期不发病(LTNP)/病程进展缓慢的患者（SP）Nef基因产生突变或者缺失［1-3］, 研究不同AIDS阶段Nef的生物学特点发现在疾病的晚期阶段, Nef不能有效地下调MHCI, 但具有高效的促进病毒复制能力; 而在AIDS的早期进展阶段, Nef对CD4分子的下调及病毒的复制保持稳定或者增加的作用。实验结果提示Nef的功能变化与疾病的进展密切相关［4］。用突变Nef基因的病毒感染动物可以破坏病毒的致病作用［5］。应用CD4C/HIV转基因鼠(Tg)动物模型研究HIV全基因、 Nef基因及相关突变体, 发现Nef是致病的主要因素, Nef主要表达于CD4+T细胞和巨噬细胞/髄样细胞, 产生的AIDS样症状表现为细胞凋亡增加, 尤其是胸腺和外周血 CD4+和CD8+T细胞［6］。这些临床和动物实验资料表明Nef与AIDS疾病发生发展具有明显的相关性。本实验用基因工程技术表达Nef蛋白, 并制备抗体, 为Nef基因生物学活性研究奠定实验基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 菌株E.coli DH5α、 E.coli BL21(DE3)、 质粒pET28a（+）、 血管内皮细胞由本研究所保存。限制性核酸内切酶、 Taq DNA 聚合酶、 T4 DNA连接酶为Fermentas公司产品。鼠源His单克隆抗体(mAb)、 HRP标记的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。RPMI1640、 胎牛血清、 G418、 脂质体购于Invitrogen公司。TMB、 弗氏佐剂购于Sigma公司。 日本大耳朵白兔（6月龄, 体质量2 kg, 雄性）购于湖北省实验动物中心。 　　1.2 方法 　　1.2.1 pET28a（+）Nef重组表达质粒的构建与鉴定 以HIV1 HXB2基因为模板。上游引物为5′CAGGATCCATGGGTGGCAAGTGGTCA3′(引入限制性核酸内切酶BamHⅠ酶切位点), 下游引物为5′GGAATTCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTC3′(引入限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切位点)（引物由上海生工生物公司合成）。PCR扩增条件为: 94℃变性5 min; 然后94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 45 s, 30个循环; 72℃ 10 min结束扩增。用BamHⅠ和EcoRⅠ分别双酶切PCR产物HIV1 Nef和pET28a（+）原核表达载体。T4 DNA连接酶连接过夜, 将连接产物转入大肠杆菌DH5α中培养, 挑取单克隆提取质粒进行酶切和测序鉴定。 　　1.2.2 Nef蛋白原核表达与鉴定 将构建好的重组质粒pET28a（+）Nef转化到宿主菌BL21（DE3）中, 经IPTG诱导表达, 收集的细菌加入SDS凝胶上样缓冲液, 100℃煮沸3 min, 冰浴4 min, 室温下离心(12000 r/min) 1 min, 取20 μL进行SDSPAGE