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HBV X基因真核表达载体构建探究 　【关键词】 ,,HBV;真核表达载体;pCDNA3.1 摘 要 目的:构建HBV X基因与pCDNA3.1相融合的高效真核表达载体，为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础。方法:设计并合成HBV X基因的引物，从HBV DNA阳性的血清中，PCR扩增得到HBV X基因全序列，将其连接到真核表达载体pCDNA3.1上后，酶切图谱分析PCR检测和扩增产物序列分析等，鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同，酶切也得到目的基因片段，测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论:成功构建了HBV X基因的真核表达载体，为下一步研究HBV X基因及其产物的功能奠定了基础。 关键词 HBV;真核表达载体;pCDNA3.1 乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）与原发性肝细胞癌（Primary Hepatocellular Carcinoma，PHCC）密切相关，呈全球流行，严重威胁人类健康 ［1，2］ 。至今，HBV的致癌机制仍不清楚。近年来发现，HBV X基因的编码蛋白HBV X蛋白（HBx Ag）被认为在慢性HBV感染发展成HCC中起重要作用，可以在多个环节影响HCC形成和发展。我们构建了X基因的表达载体，为了深入系统地研究HBV X基因对原发性肝细胞癌发生的影响及其作用机制和发展针对该基因的抗HBV及抗肝癌技术奠定实验室基础。 　1 材料和方法 　1.1 材料 HBV DNA阳性血清样本来自我院门诊和住院病人。 1.2 主要试剂 Trireagent液购自Promega公司;γTaqDNA polymerase，限制性内切酶Kpn I和EcoR I购自华美生物工程公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天为时代科技有限公司;质粒DNA小量纯化试剂盒购自TaKaRa公司;质粒pCDNA3.1+和大肠杆菌DH5α购自博士德生物技术公司。 　1.3 方法 1.3.1 X基因产物的制备:从GeneBank获取HBV X基因全序列，设计一对特异性X基因扩增的引物，正义引物为5’CATGGTACCATG-GCTGCTAGGCTGTG3’，反义引物为5’CGT-GAATTCTGCATGGTGCTGGTGA3’，下划线部分为Kpn I和EcoR I酶切位点。该引物定义全长约 500bp左右的X基因。选取HBV DNA阳性的患 者血清，用Trireagent液裂解后，用25∶24∶1（v∶v∶v）的酚/氯仿/异戊醇抽提和乙醇沉淀纯化HBV DNA。PCR采用94°C预变性5min，94°C变性1min，53°C退火1min，72°C延伸1min，30次循环。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。用DNA回收试剂盒回收DNA。 1.3.2 质粒构建，按参考文献 ［3］ 进行:将回收的X基因和pCDNA3.1+载体分别经Kpn I和EcoR I双酶切后，用T4DNA连接酶将两者的酶切产物连接。常规技术制备感受态DH5α大肠杆菌，构建好的表达X基因的真核表达载体，命名为pCDNA3.1-X，转化感受态DH5α大肠杆菌中。扩增，保存。 1.3.3 真核表达载体的鉴定:以重组的真核表达载体为模扳，进行PCR鉴定（条件同前）;用Kpn I和EcoR I双酶酶切重组的真核表达载体，电泳进行鉴定;从转化的大肠肝菌提取质粒DNA，电泳鉴定。将重组的真核表达载体测序鉴定。 2 结果 　重组真核表达载体pCDNA3.1-X的鉴定。 　2.1 以重组表达载体pCDNA3.1-X为模板进行PCR扩增，得500bp左右的片段，与所选取的GeneBank中已知的X基因大小相符合，见图1。 　2.2 从转化的大肠杆菌中提取质粒DNA，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定得到大约为6kb的特异性片段，即重组质粒已经成功的转化大肠杆菌，见图2。测序结果显示与已知基因一致。 　 3 讨论 HBV被认为是原发性肝癌发生的高危因素之一，尤其是HBV X基因。已经证明其编码产生的X蛋白与HCC的发生密切相关，但是至今，X基因的致病机制仍不清楚，因此有必要针对X基因与HCC的关系做进一步的研究，对阻断X基因表达的方法和效果进行探讨。 X基因是HBV最小的基因开放读码框，定位于1376-1850核苷酸之间，HBV X基因序列是HBV基因内功能重叠最明显的区域。HBV X基因的编码产物HBV X蛋白（HBx蛋白或HBxAg），是由约154个氨基酸残基组成的大小为16.5kD的功能蛋白，它不仅存在于细胞质中，在细胞核中也可以检测出 ［2］ ，由此可以推断X蛋白在细胞遗传物质的产生过程中起着重要作用。 近年来在对HCC的研究中发现，HBx蛋白的作用不可忽视。目前已知X蛋白具有反式激活的作