化浊行血汤含药血清血管内皮保护作用及其体内给药时效差异探究.docVIP

化浊行血汤含药血清血管内皮保护作用及其体内给药时效差异探究 　【摘要】 　　目的观察化浊行血汤含药血清对缺氧内皮细胞的保护作用，以及其药理作用与动物灌胃给药的量-时效关系。方法以化浊行血汤不同给药方案、药后不同取血时间所得的药物血清为受试对象，培养血管内皮细胞，进行缺氧复氧实验，复氧同时给予不同化浊行血汤含药血清干预，采用MTT法观察不同含药血清对缺氧内皮细胞活性的影响。结果含药血清各组与模型组比较有显著差异(Plt;0.05)。给药后不同时间取血所获得的药物血清对缺氧内皮细胞活力的影响存在一定差异，以2次/d灌胃连续3 d，并在末次灌胃90 min后取血所得药物血清药理效应最佳。结论化浊行血汤含药血清具有保护缺氧内皮细胞的作用，其血清药效与动物给药方法存在一定时效关系。 【关键词】 化浊行血汤； 内皮细胞； 血清药理学； MTT法 　　中药复方进入体内后，不同剂量的药物其在体内的吸收、分布、代谢、排泄不同，血药浓度达峰时间和起效时间亦有较大差异。为研究中药复方化浊行血汤对内皮缺氧损伤的保护作用，本实验采用MTT法观察化浊行血汤含药血清对内皮细胞抗缺氧能力的影响，并据此筛选出合适的含药血清浓度用于后续内皮缺氧损伤的研究。 　　1 材料与仪器 　　1.1 对象雄性Sprague-dawley大鼠，体质量（250±20）g，购于山东中医药大学动物中心，符合国家二级实验动物标准；人脐静脉内皮细胞系（hUVECs，购自山东省医学科学院，自美国组织培养库ATTCCCRI－1998引进）。 　　1.2 试剂1640培养基（GIBCO公司产品）、胎牛血清（FBS，Hyclone公司产品）；四氮唑蓝(美国SIGMA)；二甲基亚砜(北京世纪银丰科技有限公司)。 　　1.3 仪器 JJT-1300超净工作台（北京半导体设备一厂）；5%CO2恒温培养箱（Forma Scientific 公司）；倒置相差显微镜（美国AO Sientific Instrument；酶标仪）；EL340I 全自动酶标仪（美国Biotok公司产品）。 　　2 方法 　　2.1 药物的配制和含药血清的制备化浊行血汤由荷叶、焦山楂、决明子、赤芍、酒大黄、路路通、虎杖、何首乌，制水蛭粉组成（全部药材来源于山东中医药大学附属医院），为水煎醇沉工艺制作浸膏，4℃贮存备用。 　　取SD大鼠按8.25 g/kg灌服化浊行血汤。中药A组大鼠按照每日灌胃两次连续3 d，中药B组大鼠按照灌胃1次/d，连续5 d，空白组灌服等量生理盐水，末次给药前禁食12 h，给药后30，60，90，150 min腹主动脉取血，分离血清并灭活、过滤除菌，置－20℃保存备用。 　　2.2 内皮细胞体外缺血、缺氧模型的建立和实验分组选择生长良好的内皮细胞，以5×104/ml 密度接种于96孔板，培养24 h后，分为正常对照组、模型组及药物（缺氧）各剂量组进行缺血、缺氧造模及干预。 ①正常组：换1640培养基（1640 90%，正常大鼠血清10%），并始终在正常条件下培养。②模型组：以2006年叶武等［1］报告的方法稍加改进。缺氧时先将缺氧罐（由干燥皿改装）提前10 min充入氮气（流速4.5 L／min），以保证缺氧罐内气体的纯度，罐周边封凡士林密闭，然后置于37℃生化培养箱中，备用。将培养板中内皮细胞换缺氧无血清1640培养基（用前预先向培养基通入氮气3 min）；将其放入缺氧罐内。缺氧6h后，将培养液换为含10％正常大鼠血清的1640培养液，置于培养箱中（空气+5%CO2）继续培养18 h，然后进行检测。③中药各剂量组：造模同模型组，缺氧6 h后，将培养液换成含10％SD大鼠药物血清的1640培养液，置于培养箱中（空气+5% CO2）继续培养18 h，然后进行检测。 　　2.3 四氮唑蓝(MTT)检测各组内皮细胞两次，各加入1640 100 μl，MTT 15 μl，继续置培养箱中孵育4 h。吸弃孔内液体，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100 μl，终止反应。振荡器振荡10 min，全自动酶标仪490 nm波长，空白孔调零，测定各孔吸光度（OD）值。 　　2.4 统计学处理使用SPSS10.0软件进行统计。组内差异采用t检验，组间差异采用多因素方差分析，F检验(Avon)。 　　　3 结果 　　3.1 各组内皮细胞形态特征变化镜下观察正常组内皮细胞展开贴壁，形态无明显改变。体外模拟缺氧6 h后模型组内皮细胞回缩，间隙变大，变圆细胞增多，常规培养18 h后大量内皮细胞变圆并呈团漂浮，折光性增强。中剂量中药各组镜下观察缺氧并经含药血清干预后也可见细胞回缩，部分细胞变圆并漂浮；但各组仍见贴壁的内皮细胞数量明显多于模型组，漂浮变圆细胞明显少于模型组。 　　3.2 各组内皮细胞缺血缺氧后细胞活力的比较（MTT实验