重组肺炎克雷伯氏菌转化甘油为聚羟基丙酸.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３７（６）：８６９２ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 重组肺炎克雷伯氏菌转化甘油为聚３羟基丙酸 １ ２ １ １ １ 窦一涵 　李　映 　赵　鹏 　范如婷 　田平芳 （１北京化工大学生命科学与技术学院　北京　１０００２９　２北京联合大学生物化学工程学院　北京　１０００２３） 摘要　聚３羟基丙酸［Ｐｏｌｙ（３ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ），Ｐ３ＨＰ］是一种生物可降解及生物相容的新型聚 羟基脂肪酸酯。目前已鉴定的生物均不能天然合成Ｐ３ＨＰ。采用ＰＣＲ克隆鼠伤寒沙门氏菌的丙 醛脱氢酶（ＰｄｕＰ）基因及罗尔斯通氏菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶（ＰｈａＣ）基因，构建共表达载体， 转化肺炎克雷伯氏菌后获得两株重组菌。以甘油为唯一碳源进行摇瓶发酵，ｐｄｕＰ和ｐｈａＣ共用 ｔａｃ启动子的工程菌Ｋ．ｐ（ｐＥＴｔａｃｐｄｕＰｐｈａＣ）产生０．０５４ｇ／Ｌ的Ｐ３ＨＰ，而ｐｄｕＰ和ｐｈａＣ各自独用 ｔａｃ启动子的工程菌Ｋ．ｐ（ｐＥＴｔａｃｐｄｕＰｔａｃｐｈａＣ）产生０．０９１ｇ／Ｌ的Ｐ３ＨＰ。 关键词　肺炎克雷伯氏菌　聚３羟基丙酸　甘油　丙醛脱氢酶　聚羟基脂肪酸酯合成酶 中图分类号　Ｑ８１９ ［１５］ 　　当环境中碳源过剩时，许多微生物在胞内合成聚 Ｐ３ＨＰ涉及３步酶催化 ：（１）甘油脱水酶（ＤｈａＢ）催 ［１２］ 化甘油（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）生成３羟基丙醛（３ＨＰＡ）；（２）丙醛 羟基脂肪酸酯 （ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ，ＰＨＡｓ） 。 ＰＨＡｓ是一类由羟基脂肪酸单体聚合而成的线性聚 脱氢酶（ＰｄｕＰ）催化 ３ＨＰＡ生成 ３羟基丙酰辅酶 Ａ 酯。ＰＨＡｓ不仅具有从坚硬质脆到柔软弹性的不同材 （３ＨＰＣｏＡ）；（３）聚酯合成酶（ＰｈａＣ）将３ＨＰＣｏＡ聚合 ［３］ 为Ｐ３ＨＰ（图１）。拟以肺炎克雷伯氏菌为宿主，异源表 料学性能 ，而且具备石化基塑料无法比拟的生物 ［４］ 达 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ 可降解性和生物相容性 。由于上述优良性能， ＰＨＡｓ已成为医用和食品工业等领域极具前景的新型 ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＬＴ２的丙醛脱氢酶（ＰｄｕＰ）及罗尔斯通氏 材 料 ［５６］。 聚 ３羟 基 丙 酸 ［ｐｏｌｙ （３ 菌ＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａＨ１６的聚酯合成酶（ＰｈａＣ），以甘 ［７］ 油为碳源发酵生产Ｐ３ＨＰ。通过优化关键酶表达，提高 ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ），Ｐ３ＨＰ］是ＰＨＡ家族的新成员 ， ［８］ 甘油转化率和Ｐ３ＨＰ的产量。 其单体３羟基丙酸（３ＨＰ）是重要的平台化合物 。 化学合成Ｐ３ＨＰ包括内酯开环聚合和直接缩聚，因工 １　材料与方法 艺成本高及毒性而限制了研发 ［９１０］。近年来 Ｐ３ＨＰ １．１　菌株、载体及引物 的研究日益增多，其工程菌发酵一般采用廉价碳源， ［１１１２］ 　　 菌株 Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＡ４０５，Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ，Ｒ． 且无需添加昂贵前体物 。 ｅｕｔｒｏｐｈａ及表达载体ｐＥＴ２８ａ为本实验室保