谷氨酰胺体外对大鼠晶状体上皮细胞HSP70和NFκB表达的影响.docVIP

　　谷氨酰胺体外对大鼠晶状体上皮细胞HSP70和NFκB表达的影响 ：刘瑜,鲁建华,张文芳,李姗姗,曲来强 【摘要】 目的：探讨谷氨酰胺(Gln)体外对晶状体上皮细胞HSP70和NFκB的作用。方法：采用ELISA法检测在MEM培养液里培养3,12和24h晶状体上皮细胞HSP70和NFκB的表达水平。结果：谷氨酰胺注射各组HSP70蛋白的表达量均显著高于对照组(Plt;0.05)，谷氨酰胺注射各组NFκB的表达较对照组显著降低(Plt;0.05)。结论：谷氨酰胺能诱导晶状体上皮HSP70蛋白的表达，抑制NFκB的表达。 【关键词】 谷氨酰胺;热休克蛋白70;核转录因子;晶状体上皮细胞;紫外线 　　白内障是当今国内外的第一致盲的眼病，同时也是眼科的常见病，估计目前全世界有2500万人因此而失明。我国目前盲人中约有半数是白内障引起的，并且每年新增白内障患者约40万。随着人口增加和老龄化，这一数字还会增加。现今对白内障的 治疗 主要还是以手术治疗为主，因此研究白内障的非手术疗法来预防和治疗白内障势在必行，白内障的发病原因很多，有老化、遗传、代谢异常、外伤、辐射、中毒、局部营养障碍等，其中紫外线引起白内障的现象已经在许多流行病学和实验研究中得到证实[1]。大量的实验研究已经证明HSP70在紫外线和氧化损伤所致白内障的晶状体上皮细胞中处于高表达的水平，在晶状体上皮细胞的凋亡和晶状体蛋白变性等方面具有积极的保护作用，热休克蛋白70的研究已经成了白内障基础研究的热点;细胞核转录因子核因子κB(NFκB)是一种作用广泛的转录因子,在高等生物受外界免疫、应激和炎症等刺激后发生的细胞早期反应以及相关基因表达方面起着重要的调节作用,参与炎症反应、生长调控和细胞凋亡。谷氨酰胺(Gln)是一种条件性必需氨基酸，当人体处于应激条件下时，Gln不能满足人体需要，而添加Gln有助于增强人体的抗应激能力。近年研究发现，Gln能诱导小鼠肝脏、子宫、卵巢组织和囊胚HSP70的表达，并且HSP70的表达随着Gln剂量的加大而增加[2]，耿桂启等[3]研究显示谷氨酰胺预处理可抑制大鼠肠缺血/再灌注后肺组织NFκB的表达,其机制可能与诱导HSP270表达有关。但是国内外关于Gln对大鼠晶状体上皮细胞HSP70和NFκB表达的影响还尚未见报道，我们通过ELISA法研究紫外线所致白内障晶状体上皮HSP70和NFκB的表达及谷氨酰胺对表1HSP70和NFκB在晶状体上皮细胞的表达含量和12h晶状体混浊程度其的影响。拟解决的关键问题旨在明确Gln是否能够诱导大鼠晶状体上皮细胞中HSP70的表达及对NFκB表达的影响，以期通过调控晶状体上皮细胞中NFκB和HSP70的表达实现增强晶状体上皮细胞抗氧化应激能力和保护晶状体上皮细胞。 　 　1材料和方法 　　1.1材料 　　健康SPF级SD大鼠60只(兰州大学实验动物中心提供)雌雄兼备，体质量180～240g。实验前双眼前节检测均正常，对动物的处置方法符合动物伦 理学 要求。谷氨酰胺准品(干粉状，由武汉博士德公司提供)，MEM培养液，胎牛血清，大鼠热休克蛋白70(HSP70)ELISA Kit，大鼠核转录因子核因子κB(NFκB)ELISA Kit(USLIFETM公司)，ELISA(酶联免疫仪)和UV光源选用250EM培养液(100mL/L小牛血清，青霉素100kU/L,链霉素0.1g/L,pH7.4)的24孔培养液内，置50mL/L CO2的培养箱中恒温37℃培养8h后，弃去因操作损伤致混浊的晶状体，留取透明晶状体进行实验。将筛选好的120只各组透明晶状体，置于紫外线光源下方50cm处，撇去培养液盖板，晶状体表面上液保留约1mm,其余培养液移走照射30min，照射完毕后送回培养箱继续培养，分别于照射后继续培养3,12,24h后进行检测。制备SD大鼠晶状体匀浆[1]：用圈匙托起晶状体，称后，置于含8.6g/L生理盐水匀浆器内，在冰浴下磨研5min，10000r/min高速离心15min，取上清液测定各指标;用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗HSP70或NFκB抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗HSP70抗体、NFκB抗体，HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HSP70和NFκB呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(A值)， 计算 样品HSP70或NFκB浓度。 　　统计学分析：所有数据采用SPSS 16.0软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，若差异有统计学意义，两组间比较用最小显著差LSDt检验，Plt;0.05为差