戊二醛交联几丁质固定化青霉素G酰化酶及其性质探究.docVIP

戊二醛交联几丁质固定化青霉素G酰化酶及其性质探究摘　要：目的　以几丁质为载体，戊二醛为交联剂固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶。方法单因素优化固定化条件，以交联度、pH、温度、酶量4因素3水平正交试验，确定最佳固定化条件，并研究固定化酶的最适反应温度、pH及批次稳定性。结果最佳固定化条件为几丁质0.3g，酶量6.0mL，交联度1.5％，温度37℃，pH 8.0，时间48h，固定化酶最高比活性为62.3 U／g湿载体，最适反应温度为65℃，最适pH 9.0，重复使用8批活性基本稳定。结论戊二醛交联几丁质固定化青霉素G酰化酶稳定性较好，具有一定的工业应用前景。 关键词：青霉素G酰化酶：几丁质；戊二醛；固定化 中图分类号：Q814.2　文献标识码：A　文章编号：1672-979X(2010)11-0392-05 固定化酶技术是近年发展较快的一项生物技术。与游离酶比较，固定化酶稳定性高，酸碱耐受性强，酶与底物及产物容易分离，且可重复使用。酶固定化载体应具有多孔或网络结构，适当的亲水性，外界因素耐受性，易于衍生以提供合适的反应基团。工业用酶的固定化载体应来源广泛，价格低廉，具备一定强度，反应过程中能够搅拌和压缩等。 几丁质(常称甲壳质)是由乙酰氨基葡糖以β-1.4糖苷键连接而成的天然线性氨基多糖。几丁质作为固定化材料的研究相对较少。我们选用粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶为目的酶，研究戊二醛交联几丁质固定化酶，并探讨了其性质。 l　材料与方法 1.1　材料与仪器 几丁质(工业级，济南海得贝公司)；粪产碱杆菌青霉素G酰化酶液(Alcaligenes faecalis penicillin Gacylase，64U／mL，华东理工大学鲁华生物技术研究所惠赠)；青霉索G钾盐(华北制药)；对二甲氨基苯甲醛(PDAB)和50％戊二醛(上海精纯试剂)；其余试剂均为分析纯。 WFJ-7220型可见分光光度计(尤尼柯仪器公司)；循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸)；SHA-C水浴恒温振荡器(金坛恒丰)。 1.2　载体制备 片状几丁质用粉碎机粉碎后，6mol／L盐酸浸泡2h，抽滤，pH 7.5磷酸缓冲液洗至中性：5mol／L氢氧化钠溶液沸水浴保温1h，抽滤，pH 7.5磷酸缓冲液洗至中性；最后用1％乙酸搅拌洗涤，pH 7.5磷酸缓冲液洗至中性：60℃烘干。 1.3　固定化青霉素G酰化酶 称取经处理的几丁质0.3g，加入15mL一定浓度的戊二醛，交联24h，抽滤，用蒸馏水反复洗涤除掉残余的戊二醛。交联后的载体加适量酶液，并加不同pH的缓冲溶液定至总体积为12mL，在不同温度、pH下固定化一段时间，抽滤，用pH 7.5缓冲液反复洗去载体表面残余酶液。 1.4　酶活性测定方法(PDAB法) PDAB显色液与酶催化青霉素G钾盐生成的6-APA作用，酸性条件下生成的黄色溶液(希夫碱，Sehiff base)在415 nm处有最大吸收。以0.1mol／L磷酸钾缓冲液(pH 7.8)为反应介质，以4％(w／v)青霉素G钾盐作底物，于37℃用酶水解5min，以1min水解青霉素产生1gtmol 6-APA所需的酶量为1个酶活性单位(u)。 2　结果与讨论 2.1　固定化条件的优化 2.1.1　交联度对固定化的影响见图l。由图1可见，固定化酶的活性随戊二醛浓度增加先逐渐增大而后迅速减小，交联度2％时酶活性最高。固定化体系中的戊二醛低于2％时，与壳聚糖的氨基反应生成活性基团，后全部与酶分子结合，故固定化酶活性呈升高趋势。戊二醛浓度过大时，过量的交联剂与氨基产生大面积的分子内或分子间交联，造成酶与载体结合的能力降低。 图1交联度对固定化效果的影响 2.1.2　pH对固定化的影响见图2。随着pH逐渐增大固定化酶活性相应升高，pH 8.0时固定化效果最好，体系pH大于8.0时固定化效果开始变差。原因是低pH时酶分子带正电荷，不利于与戊二醛发生亲核加成反应：而pH较高时，酶固定化后构象改变而丧失活性，且高pH状态也不利于希夫碱，固定化酶的稳定性变差。 2.1.3　温度对固定化的影响见图3。在4～25℃之间固定化酶活性增加较缓慢，25～37℃之间，随温度上升酶活性较大幅度增加，37℃时达到峰值，而后缓慢下降。原因为温度升高有利于酶分子扩散以及与载体基团的键合反应，但过高的温度破坏了酶蛋白的空间结构，造成酶失活。 2.1.4　离子强度对固定化的影响见图4。实验结果表明，氯化钾浓度在0.80 mol／L以下时，相对酶活保持在80％以上，推测低浓度盐促进酶溶，对固定化酶影响不大；盐浓度过高促进盐析，也不利于酶与载体结合，使酶活性下降。一定范围内，离子强度对酶活性的影响不大