戊己水煎液对幽门螺杆菌感染胃上皮细胞凋亡作用.docVIP

戊己水煎液对幽门螺杆菌感染胃上皮细胞凋亡作用摘要：目的：探讨戊己水煎液(和荆局方)对幽门螺杆菌(Hpylori)感染的SGC-7901细胞凋亡的作用。方法：将Hpylorl接种于SGG-7901细胞，然后加入不同浓度的戊己水煎液，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测SGC-7901细胞凋亡的组蛋白DNA片断。结果：不同浓度的戊己水煎液组其细胞凋亡与对照组比较有显著差异(P0.05)。结论：戊己水煎液具有抑制Hpylofi感染的SGG－7901细胞凋亡的作用，而且随着戊己水煎液浓度的降低，抑制Hpylori感染的SGC-7901细胞凋亡的程度降低。 关键词：幽门螺杆茵；和剂局方戊己水煎液；SGG-7901细胞：细胞凋亡 中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1673-7717(2007)11-2365-03 幽门螺杆菌(Hellcobacter pylori，Hpylori)是一种寄居在人胃内的革兰氏阴性微需氧细菌。自从1983年澳大利亚学者分离和培养Hpylori以来，人类对Hpylori的认识不断深入。近年来发现Hpylofi是胃十二指肠溃疡的主要致病因素。体内外研究显示Hpylori感染可能是胃癌发生的重要因素1994年WHO将其确立为I类致癌因子。 中药经方戊己丸(《太平惠民和剂局方》)，是传统治疗胃部疾患的良好方剂。在治疗慢性胃炎、消化性溃疡的临床观察中其疗效早有报道，但是治疗机理尚不十分清楚。本实验欲从体外探讨戊己丸对Hpylori感染和胃黏膜上皮细胞凋亡的关系。现将实验结果报道如下。 1　材料与方法 1.1　材料 1.1.1　茵株和细胞Hpylofi采用国际标准菌株SS1(sydney strain 1)，该菌株含有细胞空泡毒素(VacA)和细胞毒素相关基因(CagA)。人胃上皮细胞系SGC-7901细胞引自中南大学湘雅医学院细胞实验中心。 1.1.2　实验药物 戊己水煎液成分即取自戊己丸(由黄连、吴茱萸、白芍3药等比例组成)，由湖南中医药大学药学院植物药化学分析研究室与药物制剂研究室制备(浓度1g／mL)。抗生素混合液(万古霉素10mg／L，两性酶素B2mg／L，多黏膜菌素B 0.25mg／L)自配。 1.1.3　实验试剂 空肠弯曲菌琼脂基础(上海腹泻病控制上海试剂供应研究中心)。RPMI 1640培养液(USA GIB-CO)。小牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)。胰蛋白酶、DMSO(USA Difco公司)。ELISA细胞凋亡试剂盒(德国宝灵曼公司，Gat.NO.1794223)。Triton X-100(北京鼎国生物技术发展公司)。 1.1.4　实验仪器 WMZK-02型厌氧培养箱，浙江义乌冷冻机总厂。x―sB―1A型倒置显微镜，广西梧州光学仪器厂。3111型C02水套培养箱，USA FORMA。TECANSUNRISE型酶标分析仪，奥地利。高速冷冻离心机(TGL16M)，长沙科威实业有限公司。 1.2 方法 1.2.1　Hpylori的活化取0.1mL冻融的Hpylofi菌置于改良Skirrow琼脂培养基平板上，涂布均匀，于37℃微需氧环境(N285％，C0210％，O25％)培养72h。 1.2.2　细胞培养SGC-7901细胞用含20％小牛血清的RPMI 1640培养液进行培养。转种时调整细胞的密度(1×105／mL)。 1.2.3　细胞凋亡的测定ELISA方法检测：参照Hated方法检测凋亡细胞组蛋白DNA片断。将SGG-7901细胞(1×105／mL)转种至小青霉素瓶中培养，24h后用HankS液清洗细胞2次，然后用RPMI 1640完全培基(不加双抗)配成的不同浓度的戊己水煎液(1:160、1:320、1：640、1：1280)和Hpylori菌悬液(浓度为l×107CFU／mL)加入生长状态良好，长满单层的细胞中，药液每孔加0.9mL,菌悬液每孔加0.1mL，每瓶液体体积1mL。于37℃，微需氧环境培养。24h后低温低速离心10min(200r／min，4℃)，弃上清。细胞沉淀加200μL细胞裂解液Triton x-100(用PBS配制成0.1％的浓度)，室温下孵育30min，低温低速离心10min(200r／min，4℃)，取上清液20μL于酶标板各孔中，另一孔加20μL组蛋白－DNA复合物作为阳性对照。各孔中加80μL免疫反应复合物(生物素标记抗组蛋白抗体：过氧化物酶标记抗DNA抗体：孵育缓冲液=1:1:18，临用前配制)混匀，盖上封片，室温下振荡反应2h。倾去各孔内液体，加250μL孵育缓冲液洗涤各孔，共洗3次，加100μL底物液，另加一孔底物液作为比色空白对照，