人脂肪间充质干细胞冻存方法改进.docVIP

人脂肪间充质干细胞冻存方法改进[摘要]目的：探索理想的冷冻人脂肪间充质干细胞的方法。 方法：采用常规方法体外培养并扩增人脂肪间充质干细胞，消化细胞并洗涤离心加入10％二甲基亚砜、30％胎牛血清、60％MEM的细胞冻存体系，直接置-70℃冰箱贮存。冻存4、8和12周后，37℃水浴复温，通过检测细胞周期细胞表型和成脂的多向分化潜能，以鉴定该方法的可行性。结果：消化后不经过传统的程序性降温冻存技术，直接在-70℃冰箱赡存，其细胞生物学特性无明显改变，细胞仍存在成脂的多向分化潜能。结论：人脂肪间充质干细胞悬液直接-70℃冰箱贮存不影响其生：物学特性，是冷冻保存的一种可行方法。 [关键词]人脂肪间充质干细胞；分化；脂肪细胞；冷冻贮存 人脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下，可以分化为成骨、软骨、脂肪等多种细胞，是组织工程，尤其是骨或软骨组织损伤修复中重要的种子细胞。因此，对其体外分离培养、扩增及保存方法等研究具有重要的意义。人脂肪间充质干细胞分离培养周期较长，原代细胞铺满的时间约2周以上，达到实验用的数量一般需要3剧左右。我们在工作中发现，人脂肪间充质干细胞体外长期培养传代容易发生自发分化，失去其多向分化的潜能。为保证实验的连续性，随时提供大量的实验或组织工稗用的种子细胞，建立～种行之有效的方法是必要的，通过检测人脂肪间充质干细胞在冻存复苏后的细胞周期，细胞表型和成脂的多向分化潜能来鉴定冻存方法的可靠性。 1　材料和方法 1．1　人脂肪间充质干细胞的分离纯化及培养：脂肪组织来源于兰州军区兰州总医院美容中心行脂肪抽吸术的患者，身体健康。无菌条件下，在局部肿胀麻醉下采用注射器法抽取50ml脂肪组织，静置半小时，去除上清液体，获得纯度较高的脂肪颗粒，用等容的D-Hanks平衡盐液清洗4次，去除细胞碎片。然后用150ml HBSS(含0.075％胶原酶I)，在37℃，振动消化1h。胶原酶I的活性用等量的MEM(含10％的胎牛血清)中和之后离心1200r，10min。细胞被悬浮在MEM(含10％的胎牛血清)用100目筛网过滤。离心后，细胞悬浮在培养基中。加至培养瓶，37℃，C0孵箱中培养24h，未贴壁的细胞和残渣被除掉，新鲜培养液加至贴壁细胞。细胞培养至80％融合时，用胰酶／EDTA消化和按1:1的比例传代。 1．2　人脂肪间充质干细胞的冷冻保存及复苏：取原代或扩增培养的人脂肪间充质干细胞的培养瓶吸弃培养体系，胰酶／EDTA消化，加PBS洗涤后加入现配的含10％DMSO、30％胎牛血清的MFM的冻存体系，按12ml／瓶将瓶底面积铺满，密封瓶口，用包裹两层，平整存放于至-70℃低温冰箱。存不同时间后，取出含细胞的培养瓶，放入水温38℃～40℃的恒温水浴箱快速解冻。此时操作应避免剧烈晃动，以免使细胞损伤，待冰块基本融化后弃上清，用PBS洗涤2次，加入MEM的培养体系，37℃培养箱内培养。需要注意的是，细胞冻存体系必须配制后再加入细胞中，各种成分不能单独加入，并且冻存的细胞尽可能短时间存放在液体状态下的冻存体系中。 1．3　冻存前后人脂肪间充质干细胞表面标志的鉴定：培养的脂肪干细胞经过消化离心(1000r／min,5min)后细胞重悬；细胞计数后将细胞浓度调整为1×10／L，分别于人抗CD34、CD44、CD45、CE108、CD49d和HLA－DR单克隆抗体室温反应30min，PBS洗涤2次后于FITC标记的二抗避光作用30min。用PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。 1．4　冻存前后人脂肪间充质干细胞细胞周期的测定：培养的脂肪干细胞经过消化离心(1000r／min，5min)，调整细胞浓度至1×10／L，用70％的冰乙醇固定24h，RNaseA处理30min，PI染色10min。用Cellquest软件获取10000个细胞，ModiFit分析细胞周期。 1．5　人脂肪间充质干细胞多向分化的诱导：取冻存前后的人脂肪间充质干细胞，脂肪细胞的诱导：细胞以2×10细胞／孔接种于6孔培养板，其中含有1μmol／L的地塞米松、0.5mmol／L的甲基黄嘌呤异丁酯、100mmol,／L的消炎痛、10％的胎牛血清DMEM(试剂均为终浓度，SIGMA公刮产品)。 2　结果 2．1　人脂肪间充质干细胞的分离纯化、扩增培养及形态特征：倒置生物显微镜下观察，接种后48h，极少数细胞贴壁，呈梭形，4天后细胞呈纤维集落样生长，大约8～10天，细胞迅速生长并形成克隆，2周左右细胞近80％～90％汇合，出现致密的贴壁层。继续培养，可见有自发分化的现象出现不典型的聚集的小脂泡。 2．2　人脂肪间充质干细胞的表型特征流式细胞仪检测结果显示：脂肪千细胞均一的表达CD44、CD106阳性，而CD3