人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤构建.docVIP

人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤构建[摘要]目的：改良传统人表皮干细胞（hESCs）分离、培养方法，为组织工程皮肤构建提供产率更高、活力更好的种子细胞。方法：应用改良的酶消化法（改良法）及传统酶消化法（传统法）分离、培养hESCs，倒置显微镜观察细胞形态，MTT法绘制生长曲线、免疫组化法测定hESCs标志物角蛋白19（K19）和β1整合素的表达，并且进一步比较上述两种方法所获种子细胞构建的组织工程皮肤的形态学的特性。结果：台盼蓝染色显示改良法细胞消化分离数为92.25±15.61个，传统法细胞消化分离数为68.50 ± 26.91个（P 1.2人表皮干细胞分离、培养：修剪皮下结缔组织，0.9% NaCl浸泡、清洗3遍，每次5～10min，0.05%醋酸氯已定+0.9% NaCl（1:2，体积比）浸泡5～8min，再次0.9% NaCl浸泡清洗3遍，每次10min，然后将上述组织块置于4℃ Dispase酶(0.25%)浸泡14～16h。以下为两种方法分离人表皮干细胞。 传统方法：取出皮片，0.9% NaCl反复清洗，分离表皮和真皮层，剪碎表皮为1.0mm×1.0mm，加0.25% Trypsin + 0.02% EDTA，37 ℃水浴10min加入含有10% FBS的DEME终止消化。反复吹吸至细胞悬浮，200目筛网过滤，1 000rpm离心5～10min，弃上清，收集细胞，用人表皮干细胞培养基重新悬浮细胞（10ml），吹打成单细胞悬液，台盼蓝染色。并接种于预先铺有Ⅳ型胶原的25cm2培养瓶内，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育10～15 min后，吸出培养液及未贴壁细胞，PBS洗2次，加入适量新鲜培养基（K-SFM，5ng/ml hEGF，30 μg/ml BPE）继续培养。 改良方法：取出皮片，0.9%氯化钠反复清洗，分离表皮和真皮层，将表皮置于小抗生素瓶后加0.125% Trypsin+ 0.01% EDTA3ml，弯头吸管快速搅拌2min，吸出并加入离心管（已经加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，再次重复消化一次，吸出后加入另一离心管（已经加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，将前后两次消化液体合并，离心（1 000rpm，5min），PBS10ml悬浮细胞，台盼蓝染色鉴定后，再次离心（1000rpm，5min），表皮干细胞培养基（K-SFM）悬浮细胞，接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶内，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育4～5min后，吸出培养液及未贴壁细胞，PBS洗2次,加入适量新鲜表皮细胞培养基培养（K-SFM，5ng/ml hEGF, 30μg/ml BPE）。 1.3表皮干细胞增殖：将两种方法分离出的hESCs分别作MTT比色试验。两组细胞均以1×105个/孔的密度接种预先铺有Ⅳ型胶原的24孔板内，每24h取3孔做MTT比色实验。根据每天记录的细胞数绘制细胞生长曲线图。 1.4 表皮干细胞鉴定：取二代表皮干细胞培养36 h，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗；0.1%Triton X-100孵育10min；PBS清洗3次，每次5min；3%H2O2去离子水孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶活性；2%山羊血清封闭20 min,加入CK19（1:50稀释）、整合素-β1（1:50稀释）一抗4 ℃过夜；PBS洗5次，滴加生物素化二抗工作液200μl，37℃孵育10min，PBS洗5次；滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液200μl, 37℃孵育10min，PBS洗5次；显色剂显色。 1.5构建组织工程皮肤：以两种不同方法分离、培养的hESCs为种子细胞，鼠尾胶原复合成纤维细胞作为支架材料构建组织工程皮肤。4ml 5×DMEM和14ml胶原于冰上混匀，用1mol/L NaOH调至中性后，加入2mlFBS（含2×106成纤维细胞）混匀，以3ml/孔加入Transwell小室内，放入37℃，5% CO2孵箱培育，待其凝固后加入10% FBS的DMEM，继续培养，24h后将2代hESCs以3×106/孔种植于鼠尾胶原表面，气-液面培养1周。 1.6 统计学分析：采用SPSS11.0软件进行统计处理，实验数据以x±s表示，两组间均数比较行两样本t的方差分析， P＜0.05为差异有显著性意义。 2结果 2.1 改良消化法和传统消化法细胞消化效率的比较：将同一块包皮组织等份分开，用两种方法同时分离表皮细胞，台盼蓝染色、细胞计数（总体积均为10ml），实验独立重复5次。 2.2改良法和传统法分离细胞形态学比较：采用Ⅳ型胶原粘附法分选表皮干细胞，改良法较传统法粘附细胞密度大，4h后大部分细胞贴壁良好，镜下可