人表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子纳米缓释剂对成纤维细胞影响.docVIP

人表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子纳米缓释剂对成纤维细胞影响作者：隋继强，韩岩，吴红，郑岩，易成刚，郭树忠 [摘]目的：制备碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人表皮生长因子(EGF)可降解缓释微球，考察其生物活性的保存情况，以及它们对成纤维细胞的作用。方法：采用改良的乳化冷凝法交联制备复合bFGF、EGF的明胶缓释微球，将它们加入成纤维细胞的培养液中，用细胞计数法、四甲基偶氮唑盐微量反应比色法(MTT法)测定细胞增殖情况。结果：复合bFGF、EGF的缓释微球平均粒径(11．32±3．64)μm；培养1天后各组细胞计数、吸光度(A)值差异均无显著性；5天后，两种生长因子缓释微球组细胞计数、吸光度(A)值明显高于对照组；7天后，两种生长因子缓释微球组值仍高于其它组，但差异无显著性。结论：复合bFGF、EGF的缓释微球制备工艺简便，成球性好；能较长时间地持续释放活性bFGF、EGF，可促进成纤维细胞的增殖。 [关键词]成纤维细胞生长因子；人表皮生长因子；微球体；明胶；成纤维细胞；缓释制剂 [中图分类号]R813 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(206)12-1342-04 基金项目：陕西省自然基金(编号：434512201) 通讯作者：郭树忠，教授，博士研究生导师，主任医师； E-mail：shuzhong@fmmu．edu．cn 人表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的应用研究一直是创面治疗领域最活跃的课题之一。但是，bFGF在体内的半衰期仅为3-10min，全身或局部应用的效果不能满足临床应用需要。表皮生长因子的变异性蛋白质二级空间结构限制了其内在的生物功能特性，而且局部使用的表皮生长因子类制剂在接触皮肤创面的数分钟内就可被创面渗出液中的蛋白酶降解破坏，被降解的小分子肽又可在创面引起明显的局部炎性反应，所以在临床应用中难以发挥促进上皮增殖的作用。因此，有学者开始研究bFGF微球等缓释制剂的类似作用。经检索文献，目前国内只有bFGF缓释制剂、EGF缓释制剂及其相关实验研究的报道，而未见到bFGF、EGF两种生长因子缓释制剂合用对创面治疗相关实验研究的报道。bFGF、EGF制备成纳米缓释剂后，其生物活性的保存情况是衡量微球质量的一项重要指标。因此，我们将bFGF、EGF两种生长因子缓释制剂加入成纤维细胞培养液中，采用细胞计数法、细胞活力检测法和细胞周期分析法，考察纳米缓释剂中bFGF、EGF两种生长因子生物活性的保存情况，并观察缓释bFGF、EGF对成纤维细胞的作用。 1　材料和方法 1．1试剂与设备：bFGF冻干粉剂、EGF(珠海亿胜生物制剂有限公司)、DMEM复合培养液(美国Gileco公司)、明胶(等电点50，相对分了量99000，美国Sigma公司)、Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)、胰蛋白酶(美国Sigma公司)、噻唑蓝(美国Sigma公司)、美国Bio-RAD Model 550酶标分析仪、美国Elite SP型流式细胞仪、日本H600．1V型透射电镜、美国FJ-2003型计数仪。自制bFGF-明胶微球、EGF-明胶微球。人bFGF定量ELLSA试剂盒(QuantiKineR，RDsystems)，250g／L戊二醛、丙酮、异丙醇、无水乙醚、液体石蜡、氨基乙酸为国产分析纯，Span-80(美国Sigma公司)为进口分析纯，水为双叹蒸水，JJ21型精确电子搅拌仪，TGL216G高速离心机，GENESIS冻干机(Virtis公司)，BX241数码显微镜(Olympus)。 1．2方法 1．2．1 bFGF-明胶微球的制备：将含有10g／L Span-80的液体石蜡30ml置于三口瓶中预热至55℃，快速搅拌下滴加入同样温度的明胶水溶液4ml，并调节搅拌速度至450r／min,继续搅拌10min；形成油包水乳剂后迅速改冰浴，继续搅拌10min,使其完全固化：加入250g／L戊二醛0．1ml,搅拌下预固化2h，4℃固化24h,用适量丙酮、异丙醇、乙醚洗涤，挥去乙醚，真空干燥，得淡黄色粉末状微球。继续用双蒸水洗涤，至有机溶剂洗净，冻干。将200μl的bFGF溶液滴加在20mg的冻干明胶微球上，在室温下保持30min以使bFGF完全融入微球。60Co照射灭菌封存。将含有bFGF的微球样本置于光镜下，观察其外形及分散度。同时测量500个微球的直径计算其平均粒径。以算术平均径为微球的平均粒径，计算公式为：平均粒径=n1 d1+n2 d2+…+nn dn／n1+n2+n3+…+nn。式中n1，n2…nn为粒子数；d1，d2…dn为粒径。 1．2．2 EGF-明胶微球的制备(同1．2．1) 1．3成纤维细胞的培养和实验分