80430极低频率电磁场对肝癌细胞Bax及Bcl-2基因表达影响.docVIP

80430极低频率电磁场对肝癌细胞Bax及Bcl-2基因表达影响[摘要] 目的 研究极低频率电磁场(Extremely Low Frequency Electromagnetic Field，ELF)对肝癌细胞Bax和Bcl-2基因表达的影响，探索ELF在治疗肝癌中的作用。方法 以正常的肝细胞L-02为对照，通过Real-timePCR和流式细胞仪(FCM)方法检测经过ELF处理过的肝癌细胞系BEL-7402的Bax和Bcl-2基因表达情况。结果 经ELF处理后BEL-7402细胞Bax基因表达明显上升，而Bcl-2基因表达显著下降，对L-02细胞则没有影响。结论 ELF能够上调促进凋亡基因Bax在肝癌细胞中的表达、下调抑制凋亡基因Bcl-2的表达，提示EMF促进肝癌细胞凋亡方面具有重要作用，为EMF在临床治疗肝癌提供了线索。 [关键词] 肝细胞癌； BAX； bcl-2； 基因表达； 凋亡 [中图分类号] R735.7[文献标识码] A[文章编号] 1005-0515（2011）-11-046-02 肝细胞癌(HCC)为原发性肝癌，在我国是最常见的恶性肿瘤之一，目前临床上仍然没有什么有效的治疗方法。极低频率电磁场(ExtremelyLowFrequencyElectromagneticField，ELF)是一种新兴的治疗肿瘤的方法[1]，已经有报道显示，ELF对于许多恶性肿瘤都有一定的治疗效果，但是ELF治疗恶性肿瘤的机制，特别是分子机制不甚明了[2-5]。本研究试图通过分析ELF对肝癌细胞系BEL-7402和正常肝细胞系L-02中Bax和Bcl-2基因表达的影响，揭示ELF对肝癌细胞凋亡相关基因影的表达响，从而探寻ELF在肝癌治疗方面的分子机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 标本 肝癌细胞系BEL-7402以及正常肝细胞L-02购自sigma公司。 1.1.2 RNeasyMiniKit试剂盒 购自QIAGEN公司产品，Bax、Bcl-2、β-actin引物购自南京金思特科技有限公司，RT试剂盒购自Tiangen公司，Real-timePCR试剂盒购自Tiangen公司，鼠抗人Bax和Bcl-2抗体购自sigma公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养的方法 用含10％胎牛血清，100U/ml的青霉素，100U/ml的链霉素的RPMI-1640培养液中，置37℃，饱和湿度5%的CO2培养箱中培养，传代，当细胞生长活力良好时使用。 1.2.2 EMF对肝癌细胞的处理 低频率电磁场由武汉市海军工程学院提供(型号:DL―D03)。额定电压220V,单相频率100Hz,由可调变压器及电阻调节输出磁场强度。将肝癌细胞系BEL-7402与胎肝细胞(L-02)接种到孔板中,并置于磁场强度分别为0.9mT的磁场中进行干预,每天刺激2次,每次1h,作用3天。 1.2.3 总RNA提取、纯化与RT-PCR 按说明书用TRIzol提取肝癌细胞系BEL-7402与正常肝细胞L-02中的总RNA，通过紫外分光光度计检测RNA的产量并检测RNA的纯度。以此RNA为模板，70℃灭活10min，加入10mmol/Loligo(dT)18,dNTP以及AMV逆转录酶，5xAMV逆转录酶缓冲液等，合成cDNA。然后加入Bax，Bcl-2,β-actin引物，分别进行PCR扩增。Bax上游引物序列：5一CGGCGAATTGGAGATGAA一3；下游引物序列：5一GTGTCCACGTCAGCAATCAT一3；Bcl-2上游引物序列：5一CATGCCGTCCTTAGAAAAATACA一3；下游引物序列：5一CTGCTTTTTATTTCATGAGGTACATT一3；β-actin上游引物序列：5-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′；下游引物序列：5-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。PCR扩增条件：94oC预变性2min，然后94℃3Osec，55oC40sec，72oC30sec共40个循环，最后72oC10min。以6ul扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，β-actin检测逆转录效率，以凝胶成像系统摄像并分析。 1.2.4 FCM检测 Bax和Bcl-2蛋白的表达：收集ELF作用后的细胞，70%冷乙醇固定2h,PBS洗涤2次，鼠抗人Bax和Bcl-2单克隆抗体室温固定30min,PBS洗涤2次，加入二抗为FITC标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG避光染色30min。同时设阴性对照用PBS代替一抗和二抗，同型对照组只加入二抗。流式细胞仪测定荧光强度。以荧光指数(FI)表示蛋白的表达情况，FI=(样本蛋白荧光强度-同型对照的荧光强度)/正常对照的荧光强度。