凌今--2010010513-基因治疗作业.docVIP

题目一：请说明基因治疗中的关键技术问题是什么？ 基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。基因治疗是在基因工程基础上发展起来的分子生物学技术，它相对于现有其它治疗方法较为复杂。基因治疗的基本过程包括以下主要方面：目的基因的选择和制备、基因的转运、靶细胞的选择、细胞转染、外源基因的表达及检测。 外源基因只有整合到染色体中，变为其中一部分才有可能得到持续的高表达，因此，基因治疗中的关键技术问题是基因转移。 基因治疗的主要步骤包括目的基因的克隆、基因转移、靶细胞的选择和临床试验观察等, 其中基因转移是基因治疗的关键步骤。基因转移方法可分为直接体内法( in vivo) 和间接体内法(ex vivo)。基因转移技术按载体又可分为四大类： 病毒载体法、非病毒性生物载体法、非生物性载体法和非载体法。 然而, 基因转移作为基因治疗的关键技术, 在将基因有效地转移到足够多的靶细胞, 并使细胞表达这些基因等方面存在不少问题。 美国国家人类基因组研究中心主任Francis Collins 认为, 目前使用的载体及转移技术中还没有一种能用于临床并永久有效的基因转移技术[2]。下面介绍几种基因转移技术： 一. 直接体内法 直接体内法是将基因直接导入体内的各种体细胞中。 直接体内法包括以下方法: ①非载体法: 质粒DNA 注射, 气雾剂吸入, 体内电穿孔; ②非生物性载体法: 脂质体, 微粒子, 基因活化基质; ③非病毒性生物载体法: 配体, 基因工程疫苗; ④病毒载体法: 重组病毒载体局部脏器注射、吸入, 病毒活疫苗口服。 这些方法操作方便, 可反复使用, 病人易于接受, 但存在外源基因对靶细胞的转染率低, 整合较少见, 表达往往是暂时的。此外, 各导入方法还存在一些有待解决的问题: 1) 质粒DNA 直接肌肉注射。 肌肉注射简单易行, 但注入的DNA 往往未整合入染色体中,游离于染色体之外, 不能复制, 表达时间太短。 2) 气雾剂吸入。 质粒DNA 或脂质体中的DNA 可通过气雾剂导入呼吸道上皮细胞, 带有 外源基因的腺病毒载体也可导入呼吸道上皮细胞[2]。 3) 体内电穿孔术。 先皮下注射质粒DNA , 然后在表皮和真皮之间加一脉冲电场进行基因 转移, 这种方法的转移效率较低[3]。 4) 脂质体体内转染法。 脂质体可以包裹DNA , 然后它被组织细胞摄入而转染靶细胞[4]。 非病毒载体基因转移的第一个临床试验乃是将包裹有DNA 的脂质体注入肿瘤中以表达异体组织的移植抗原。 但脂质体体内转染较难将DNA 导入某些靶细胞, 如肝细胞, 内皮细胞机械阻挡肝细胞与血流中的脂质体相接触。 5) 基因枪微粒子轰击法。 采用高压电极使包被质粒DNA 的金、钨微粒子高速穿入靶组织 或细胞, 从而转染靶细胞[5]。 6) 基因活化基质(gene activated medium , GAM ) 技术。 某些生物可降解的基质称作活化 基质, 如可生物降解的陶瓷、不锈钢或钛等。 1996 年9 月美国冷泉港实验室兴办的基因治疗会议上, 有人报告将浸渍外源基因的活化基质涂于骨折处或伤口, 当修补细胞长入GAM 时, 摄取外源基因, 表达可促进愈合的蛋白质[6]。 7) 配体—受体介导法。 将质粒DNA 与某种多肽性配体结合, 多肽配体再被细胞膜上的受 体识别并结合, 从而通过吞噬作用将DNA 导向特定的靶细胞。 若将DNA 在体内运送至肝, 可以先将DNA 和能与肝细胞受体特异性结合的去唾液酸糖蛋白偶联起来, 以便通过细胞内吞过程而被摄入, 这样,DNA 大部分被肝细胞所摄取[7]。 该法的缺点是内吞水泡易被溶酶体破坏, 且其表达只是暂时的。 8) 重组外源基因的病毒载体的局部或脏器直接注射[8]。 该法存在的主要问题是人血清中 的补体成分与病毒载体结合而灭活病毒载体。 二、　间接体内法 先从病人身上取得靶细胞, 将外源基因在体外转染病人靶细胞后, 再将转染的靶细胞输回病人体内的方法即间接体内法。 间接体内法包括以下方法: 非载体法: 体外电穿孔, 显微注射, 共沉淀, 同源重组; 非生物性载体法: 脂质体, 微粒子; 非病毒性生物载体法: 线粒体, 哺乳动物人工染色体(mammalian artificial chromosome, MAC) , 人类人工染色体(hum an art if i2cial chromosome, HAC) , 人类天然小染色体(human micro chromosome, HMC) ; ④病毒载体法: 逆转录病毒( retrovirus, RV )、腺病毒(adenovirus, AV )、单纯疱疹病毒(herpe