DB21∕T1887—2011猪瘟鉴别诊断技术规范.docVIP

ICS65.020.30 B41 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/ T1887—2011 猪瘟野毒株与疫苗株鉴别诊断技术规范 Techniques specification for detection and differentiation of wild-type and vaccine— viruses of Classical Swine Fever virus 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 2011 - 01 - 17发布 2011 - 02 - 01实施 辽宁省质量技术监督局发布 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则并起草。本标准附录A为资料性目录。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准由辽宁省质量技术监督局发布。本标准负责起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准起草人：段亚良 于学武 杨本勇 于长泳 魏澍 赵培 兰德松 李璐 高志峰 杨庆民 王宏燕 吴运谱 猪瘟野毒株与疫苗株鉴别诊断技术规范 范围 本标准规定了CSFV野毒与兔化弱毒疫苗株的复合荧光定量RT-PCR的鉴别诊断技术方面的要求。 级（BSL-2）以上猪瘟诊断技术 GB/T 16551按GB/T16551-2008 .2进行按GB/T16551-2008 .3进行引物和探应用MegAlign软件对GenBank中公布的34株CSFV(包括23株国内外不同基因型的野毒株和11株弱毒疫苗株)和其它瘟病毒(包括BVDV-1,BVDV-2和BDV共4株)基因组序列进行比对分析，在高度保守的5-UTR内设计了针对CSFV的通用上下游引物CSFV-F和CSFV-R(预期扩增产物大小为98-99bp)以及不同荧光基团标记的CSFV野毒特异性探针 (CSFV )和猪瘟兔化弱毒疫苗株特异性探针(CSFV)(表1 )，引物和探针由宝生物工程有限公司合成复合荧光定RT-PCR引物和探针序列及两端标记情况名称 序列 T值(℃) 基因组位置bp) CSFV F 5-GAACTGGGCTAGCCATG-3 57.01 86-102 CSFV R 5-ACTGTCCTGTACTCAGGAC-3 57.56 166-184 CSFVw 5-FAM-AGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCG-TAMARA-3 68.08 111-137 CSFVv 5-TET-TAGGACTAGCAAAACGGAGGGACTAGCCA-TAMARA-3 66.27 110-138 根据猪瘟病毒石门株(GenBank No. AF092448 )基因组位置濒死猪、扑杀猪流产胎儿取；待检活猪，用注射器2mL～4mL研磨病毒RNA用Trizol试剂(Molecular Research Center, Inc.)提取样品总RNA移取750 μL Trizol至1.5 mL Eppendorf 管μL血液（培养液或组织处理上清液），漩涡振荡20 s，室温下作用5 min。加入250 μL 三氯甲烷，漩涡振荡15 s，室温下作用10 min。 以12000 r/min（11750g），4 ℃离心15 min。 轻轻吸取上清转至新的1.5 mL Eppendorf管（注意不要吸到中间蛋白层），约550 μL~600 μL，加入等量预冷的异丙醇，颠倒数次混匀，-20℃条件下静置不少于10 min。 以12000 r/min（11750g），4 ℃离心15 min。 轻轻倒掉上清，顺势将管口残液在吸水纸上蘸干（注意各管不要用吸水纸同一点），向管中轻轻加入1 mL预冷的75%乙醇。轻轻颠倒数次，将乙醇倒掉，将管口残液在吸水纸上蘸干（注意各管不要用吸水纸同一点），盖上盖后，以5000 r/min，4℃离心2 min。 用清洁无酶吸头将管底乙醇吸干，注意不要吸走沉淀，将残留乙醇晾干，直至无乙醇味。 加50μL DEPC 水溶解RNA ，-70℃保存备用。 cDNA合取RNA μL，加入到30μL反转录反应体系中，内含5RT Buffer 6μL, dNTP(各10mmol/L ) 1μL、9-mer随机引物5pmol、禽源反转录酶(AMV RTL) 10U和RNA酶抑制剂(HPRI) 20U，42℃水浴1h，最后70℃ 15min灭活反转录酶，置-20℃备用反应体系25μL，其中含cDNA 1μL10×EX Taq Buffer 2.5μL、dNTP(各2.5mmo1/L ) 2μLMgCl2 (2.5mmo1/L) 7μL、CSFV-F(10μmo1/L)和CSFV-R(10μmo1/L)各1μLCSFVw (10μmo1/L)和CSFV(10μmo1/L)各.5μL、Hot