DB21∕T1889—2001禽白血病诊断技术规程.docVIP

ICS65.020.30 B41 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/ T1889—2011 禽白血病诊断技术规程 Regulations of diagnotic techniques for Avian-Leukemia 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 2011 - 01 - 17发布 2011 - 02 - 01实施 辽宁省质量技术监督局发布 前言 本规程按照GB/T1.1-2009给出的规则并起草。本规程的附录A、附录B为资料性附录。本规程由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本规程由辽宁省畜牧兽医局归口。本规程起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心。本规程主要起草人： 杨本勇　顾贵波　肖爱波　马建山　陈瑶　薛树山　马君敏　赵凤菊 禽白血病诊断技术规程 范围 本规程规定了禽白血病（ALV）临床诊断、实验室诊断的技术要求。 本规程适用于辽宁省境内禽白血病的诊断、疫情监测及流行病学调查。本规程中的临床诊断方法为筛选方法，筛选结果为疑似的病禽采集病料进行实验室检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规则和试验方法NY/T 680—2003 禽白血病病毒P27抗原酶联免疫吸附试验SN/T 1172—2003 禽白血病琼脂免疫扩散试验J-亚群禽白血病防治技术规范 临床诊断 临床症状 禽白血病病鸡无特异的临床症状，部分患有肿瘤的鸡表现消瘦，头部苍白，并由于肝部肿大而导致患鸡腹部增大。禽白血病感染率高的鸡群产蛋量很低。潜伏期较长，最早可见5周龄鸡发病，但主要发生于18周～25周龄的性成熟前后鸡群。总死亡率一般为2％～8％，但有时可超过10％。 剖检病变 特征性病变是肝脏、脾脏肿大，表面有弥漫性的灰白色增生性结节。在肾脏、卵巢和睾丸也可见广泛的肿瘤组织。有时在胸骨、肋骨表面出现肿瘤结节，也可见于盆骨、髋关节、膝关节周围以及头骨和椎骨表面。在骨膜下可见白色石灰样增生的肿瘤组织。 实验室诊断 病原分离鉴定 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备 取10d～12d龄SPF鸡胚按常规方法制备CEF，置于35㎜～60㎜平皿或小方瓶中。待细胞单层形成后，减少维持用培养液中的血清至1％左右。 病料的处理和接种 病料的处理 血清或血浆样品：从疑似病鸡无菌采血分离血清或血浆。 肝、脾、肾组织样品：取1g～2g组织研磨成匀浆后，按1：1加入无菌的PBS，置于1.5 mL离心管中10000r/min离心20min，用无菌吸头取出上清液，移入另一无菌离心管中，再于10000r/min离心20min，按10000IU/ mL量加入青霉素后备用。 传代培养：用胰酶溶液将感染的CEF单层消化后，再作为第2代细胞接种于另一块带有3～4片载玻片的35㎜～60㎜平皿中，继续培养7d。 病毒的检测 间接荧光试验（IFA）：将带有感染的CEF的载玻片取出，用丙酮－乙醇（7：3）混合液固定后，用ALV单克隆抗体或单因子血清及FITC标记的抗小鼠或抗鸡Ig标记抗体做间接荧光试验。在荧光显微镜下观察有关呈病毒特异性荧光的细胞。 聚合酶链式反应（PCR）：从CEF悬液提取基因组DNA作为模板，以特异引物进行扩增，回收产物进行测序；或克隆后测序，将测序结果与已发表的ALV株比较，基因序列同源性应在85％以上。 禽白血病病毒P27抗原酶联免疫吸附试验 操作方法见NY/T 680—2003。 禽白血病琼脂免疫扩散试验 操作方法见SN/T 1172—2003。 反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） 材料 样品的采集与处理 无菌采集病鸡的全血、病变组织，在无菌条件下将样品充分研磨，并加入0.04mol/L　PBS(pH7.4)制成1：5悬液，3000r/min离心10min，取上清备用。 试剂 —Taq DNA聚合酶； —AMV反转录酶； —dNTP； —DL2000 DNA Marker； —琼脂糖； —核酸提取试剂Trizol； —氯仿； —异丙醇； —DEPC水； —ddH2O； —75%乙醇（DEPC水配制）。 方法 样品总RNA的提取 取上清液250μL加入用DEPC水处理过的1.5mL离心管中，加入750μL Trizol病毒裂解液，颠倒混匀。阳性对照、阴性对照与样品同时提取RNA。 室温静置5min，加入250μL氯仿，混匀。 静置2min ，4℃12000r/min离心10min。DEPC水处理过的1.5mL离心管中，再加入等体积的异丙醇，混匀。 静置5min ，4℃12000r/min离心10min。μL75%的乙醇（用DEPC水配制）；4℃13000r/min