DB21∕T1890—2001鸡马立克氏病诊断技术规程.docVIP

ICS65.020.30 B41 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/ T1890—2011 鸡马立克氏病诊断技术规程 Regulations of diagnotic techniques for Marek’s disease 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 2011 - 01 - 17发布 2011 - 02 - 01实施 辽宁省质量技术监督局发布 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则并起草。本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：陈瑶 顾贵波 段亚良 王竹 李清竹 薛树山 赵培 邓文超 鸡马立克氏病诊断技术规程 范围 本标准规定了鸡马立克氏病(MD)的临床症状与病理变化、实验室诊断和综合判定。 本标准适用于辽宁省境内的一切从事鸡类饲养、经营和鸡类产品生产、经营以及从事动物防疫活动的单位和个人对鸡马立克氏病的诊断、疫病监测及流行病学调查。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB／T 18643-2002／T -2004 鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法 NT/T 905-2004 鸡马立克氏病强毒感染诊断技术 临床症状与病理变化 临床症状 神经型 病鸡步态不稳，发生不全或完全麻痹，不能站立，蹲伏地上，并且两腿前后伸展呈“劈叉”姿势。 皮肤型 病鸡多在颈部、翅膀和大腿外侧体表毛囊腔形成结节及小的肿瘤状物。 眼型 病鸡一侧或两侧眼睛失明，瞳孔边缘不整齐呈锯齿状，虹彩消失，眼球如鱼眼，呈灰白色。 内脏型 病鸡精神萎靡，呆顿，食欲下降，明显消瘦，常缩颈蹲在墙角下。羽毛松乱无光泽，皮肤苍白，排绿色稀便。 病理变化 神经型 外周神经肿胀，呈半透明水肿样，色泽变淡，横纹消失，其肿胀程度一般为正常神经的2倍～3倍。这些变化多发生在腰荐神经丛、坐骨神经丛、臂神经丛、颈部迷走神经丛等部位。 皮肤型 以皮肤的羽毛囊为中心，形成半球形隆起的肿瘤，其表面有时可见鳞片状棕色痂皮。 眼型 虹膜呈环状或斑点状褪色，出现淡灰色；瞳孔不规则，有时偏向虹膜一侧。 内脏型 以内脏出现肿瘤为特征，其中肝脏、腺胃的发生率最高。 病理组织学变化 采集病鸡肿胀的外周神经和内脏的肿瘤组织样品，按常规方法制备石蜡切片、苏木素伊红(HE)染色。通过普通光学显微镜进行病理组织学观察判定。 根据病变组织中浸润细胞的种类及形态学，外周神经病理组织学变化可分为A、B、C三个型。在同一只鸡的不同神经会出现不同的病变型。A型病变表现为淋巴母细胞，大、中、小淋巴细胞及巨噬细胞的增生浸润。B型病变表现神经水肿，神经纤维被水肿液分离，水肿液中多为小淋巴细胞、浆细胞和许旺氏细胞增生。C型病变为水肿和轻度小淋巴细胞增生。 内脏和其他组织的肿瘤与A型神经病变相似，为大小各异的淋巴细胞增生。 实验室诊断 病毒分离与鉴定 操作方法按SN／T -2004执行。 琼脂扩散试验检测技术 操作方法按GB／T 18643-20028℃尽快送往检测单位。在无菌室内将样品充分研磨，并加入0.04mol/L PBS(ph7.4)制成1：5悬液，3000r/min离心10min，取上清备用。阳性对照可选用马立克活疫苗。 试剂及引物 Taq DNA聚合酶，dNTP，DL2000 DNA Marker，琼脂糖，核酸提取试剂DNAzol，无水乙醇，ddH2O，75%乙醇。 引物为上游5TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG3；下游5GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC3。目的片段大小为185bp、317bp或449bp中的一个或个或三个目的片段μL加入1.5mL离心管中，加入800μL DNAzol病毒裂解液，颠倒混匀，室温放置3min。 b）10 000r/min离心10min。 c）上清转移至另一离心管内，加500μL无水乙醇，混匀，室温放置3min。。μL ddH2O水溶解DNA，-70℃保存备用。 PCR反应 在冰浴条件下，按下列试剂用量μL；10×PCR Buffer（Mg2+Free）2.5μL；dNTP Mixture（各2.5mM）2μL；上游引物1μL；下游引物1μL；MgCI2；1μL；rTaq DNA聚合酶0.25μL；ddH2O 15.25μL。 以上体系按下列程序在PCR仪进行反应：95℃ 1min，1个循环；94℃ 45sec，55℃ 45sec，72℃ 45sec，30个循环；72℃ 10min ，1个循环；4℃