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类病毒的检测方法与其蔓延方式 应佳炜 3140100484 植保1401 摘要：类病毒是一类全体仅由高度闭合的 RNA 组成的物质，主要感染植物。检测其存在的 方法有生物学、电泳、分子生物学方法等。其传播时，先进入细胞核与叶绿体，自身 大量复制后扩散到全植物体。 关键词：闭合RNA、分子生物学检测、RT-PCR、RY 结构域 类病毒（Viroid），又称感染性RNA、病原RNA、壳病毒，是一种和病毒（virus）相似 的物质，但是和病毒不同，没有蛋白质外壳，而仅仅是一个环状闭合的单链RNA 分子，含 246~401 个核苷酸。在天然状态下类病毒RNA 以高度碱基配对的棒状结构形式存在，类病 毒能耐受紫外线和作用于蛋白质的各种理化因素，如蛋白酶，胰蛋白酶，尿素等都不敏感， 不被蛋白酶或DNA 酶破坏，但对RNA 酶极为敏感。 类病毒是比已知病毒都小的能在宿主细胞内自主复制的病原体之一。它可通过植物表面 的机械损伤感染高等植物，并表现出一定的症状，也可以通过花粉和种子垂直传播。已发现 的类病毒达40 多种，其中多为植物类病毒。植物类病毒能引发多种疾病，例如番茄簇顶病， 柑桔裂皮病，黄瓜白果病，椰子死亡病等，危害很大。 类病毒病与病毒病在 症状上没有明显的区别，病毒病的大多数典型症状 也可以由类病 毒引起，包括矮化、叶脉变色、叶扭曲、 叶局部褪绿或枯斑、斑驳和整个植株死亡。类病 毒 感染后潜伏期较长，并持续感染。类病毒的侵染力强，可以通过摩擦接种传播。多数类 病毒靠无性繁殖（如嫁接、块茎繁殖）传播，有些可经种子或花 粉传播。 检测类病毒的方法很多，每种都有其适用范围和优缺点，下面一一介绍。 1.生物学检测 根据类病毒在指示植物上的特有症状来判断待 检类病毒的种类的生物 学方法是一种敏感和方便的方法。通常采用汁液摩擦接种的方法接种指示植物。也可采用嫁 接法使指示植物感病。而用类病毒核酸提取物接种指示植物可以提高症状出现比率和 加快 症状的出现速度以及提高类病毒的侵染能力。自1964 年 Raymer 等人发现番茄可作为马铃 薯纺锤块茎类病毒的指示植物以来，马铃薯类病毒的研究工作有了快速的进展。张少瑜等利 用桃实生苗GF -305 对桃潜隐花叶类病毒进行鉴定。但指示植物法需要的时间长，不同类病 毒在指示植物上的症状表现有干扰作用，如柑橘裂皮类病毒（CEvd）和 PSTvd 的寄主范围 几乎一样，并且它在寄主上引起的症状很难区分。 2.电泳方法 自 Morris 等人首次把聚丙烯酰胺凝胶电泳法用于马铃薯纺锤块茎类病毒 鉴定以来，聚丙烯酰胺凝胶电泳技术已成为广大学者研究类病毒所普遍采用的方法。随着人 们对类病毒结构的深入研究，这项技术逐渐完善起来。目前，较通用的方法为往复双向聚丙 烯酰胺凝胶电泳（return - PAGE），它是基于类病毒环状分子的特性而设计的，类病毒分子 变性后，其电泳迁移率明显慢于相同分子量的其他线性RNA 分子。在第1 向常规电泳中， 所有核酸分子按分子量大小在凝胶中分离开来，而寄主中的小分子核酸如 tRNA 已经跑到 胶外。在第2 向变性电泳中，类病毒环状分子与线状核酸分子分开，通过银染可以获得能检 测出pg 水平的类病毒样品。目前，双向往复聚丙烯酰胺凝胶电泳法是检测类病毒的主要方 法。往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用在类病毒分离物的鉴定上。SinghRP 用此方法分 离了PSTvd 的m 和s 分离物。 3.分子生物学方法 3.1 RT-PCR 方法 PCR 是 MuIIis 等在1985 年发明的一种特异性DNA 体外扩增技术。类病毒应用此方法 检测时，需要将RNA 反转录成ODNA 再进行PCR 反应，此方法称为RT-PCR，RT-PCR 的 产物经琼脂糖凝胶电泳看其是否有特异性扩增带及扩增带的碱基对的数目，以此来判断待检 测的样品是否为阳性。RT-PCR 电泳检测方法在植物类病毒的检测中显示出快速、灵敏、特 异性强的优点。与传统的 RT - PCR 相比，该 方法还具有耗时短、价格低的特点。RT - PCR 电泳方法目前已经是一种非常成熟、经常应用的方法，但此方法如操作不当，则会导致交叉 污染而出现假阳性问题。其次，由于植物抽提物对酶的抑制作用而会出现假阴性的结果，在 实际操作中应引起注意，且需要用其他方法来复合检测结果。 3. 2 核酸杂交技术核酸杂交方法是一种分子