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一种新酶联免疫法检测水产品中甲基睾丸酮【摘 要】经过对罗非鱼,鲩鱼, 海鲈和对虾加标回收试验表明，一种新的甲基睾丸酮酶联免疫检测试剂盒对水产品中甲基睾丸酮检测具有简单、快速的特点，检测回收率和精密度均可以满足水产品中甲基睾丸酮检测的需要，该快速检测方法尚未见国内有文献报道用于水产品中甲基睾丸酮的检测。 【关键词】酶联免疫 甲基睾丸酮 药物残留检测 水产品 甲基睾丸酮, 又名甲睾酮，甲基睾酮，甲基睾丸素 （外文名Methyltestosterone, MTS），是一种人工合成的白色或乳白色结晶性粉末状雄性激素，具有雄性和蛋白同化双重作用。它能促进雄性性器官发育成熟和第二性征的形成，用于鱼类中可在自然性逆转发生之前任何年龄阶段处理都可诱导转雄。而雄性鱼比雌鱼生长快，在不增加任何投入的情况下，可使养殖产量大幅度提高。甲基睾丸酮也可促进蛋白质合成代谢、提高饲料转化率和促进动物生长。 然而甲基睾丸酮在水产动物体内的代谢较慢，易残留于动物源性食品中，尤其是脂肪组织中，极小的残留都可对人类造成危害。甲基睾丸酮对妇女可能会引起类似早孕的反应及乳房胀、不规则出血等；大剂量应用影响肝脏功能；孕妇有女胎男性化和畸胎发生，容易引起新生儿溶血及黄疸。因此，农业部已明确规定禁止使用甲基睾丸酮水产品饲养中，在我国动物源性食品兽药残留监控计划中也把甲基睾丸酮列入重点监控项目。目前应用的高效液相色谱法（SC/T 3029-2006）鱼虾组织检测线为10μg/kg。但是甲基睾丸酮的检测有一定难度，液相色谱法检测限无法满足不得检出需要，且该方法前处理非常复杂，耗时长、对技术人员的要求高，检测精密度较难把握，是检测人员普遍反映难度较大的一个药残检测项目。而液相色谱串联质谱法因为仪器价格昂贵无法推广普及。因此，采用新的快速、准确的检验方法显得尤其迫切和必要。利用抗原抗体反应的高特异性而设计的高灵敏度检测方法－酶联免疫法，因其样品处理简单，检测快速准确在食品中甲基睾丸酮的检测中有着明显的优势。 我们在比较德国、荷兰、美国等生产的多个甲基睾丸酮酶联免疫检测试剂盒的基础上，选择一种新的试剂盒应用于水产品中甲基睾丸酮的检测，经过对罗非鱼,鲩鱼（塘鱼）, 海鲈（海水鱼）和对虾的加标回收试验，发现新的检测方法操作简单、精密度好、回收率等完全能满足现行标准的需要。 一、材料与方法 1.主要材料与设备 甲基睾丸酮（MTS）ELISA检测试剂盒（柏尔科技公司BIOO Scientific Corp.）；搅肉机；漩涡振荡器；氮气吹干仪；离心机；微量移液器；酶标仪；乙腈；无水MgSO4；正己烷；恒温箱；分析天平；离心管；罗非鱼,鲩鱼, 海鲈和对虾肌肉。 2.检测步骤 2.1样品前处理 称取2.0 g搅碎样品于50 mL离心管，加入6 mL乙腈，1 g无水MgSO4；漩涡振荡3分钟，4000 g离心5分钟；移取上清液1.5 mL到另一20 mL离心管，60℃~70℃氮气吹干；加入1 mL正己烷，0.75 mL 1×样品提取液；漩涡振荡1分钟，4000 g离心5分钟。离心后得到的下清液即为待测的样品提取液。 2.2ELISA检测步骤 试剂盒从冰箱拿出来回温30分钟以上。根据样品数量确定所需的微孔板数，设计好标准品和样品的排布。分别加入50 μL标准品和样品于所设定的孔中；在每一个孔中加入100 μL一抗，轻敲微孔板边缘以混匀；室温孵育30分钟；孵育后，每孔加入250 μL 1×洗液进行洗板，一共洗三次；每孔加入150 μL 1×二抗，室温孵育30分钟；之后，按照上述洗板方法再次洗板；每孔加入100 μL底物，室温孵育15分钟，再加入100 μL终止液，在酶标仪450 nm波长处测定吸光度值。 2.3回收率的测定 在样品中加入一定量的甲基睾丸酮标准品，测定其终浓度（每个加标样品平行测定8次）。回收率按下式计算： 回收率=（测定值-空白值）/加标浓度×100% 二、试验结果 1.标准曲线 标准曲线如图1所示。 图1 标准曲线（斜率k=0.11截距b=0.56 相关系数r=0.998） 2.50% 抑制浓度（IC50） 50%抑制浓度（IC50）指标准曲线上吸光度与零浓度标准溶液吸光度比值为50%处所对应的药物浓度。根据实验要求，测定5次标准曲线，用相应软件计算出每条标准曲线的IC50，即得到5次IC50，计算平均值和波动范围。结果见表1。 表1 柏尔试剂盒IC50计算结果 μg/kg 由表1可知，柏尔试剂盒IC50平均值为2.35μg/kg，波动范围为2.21~2.44μg/L之间。 3.回收率和精密度试验 取3组罗非鱼样品， 每组8个样品，每组分别添加